米乐M6官网登录入口治疗疾病的方法

　　优先权声明本申请要求2004年9月13日提交的美国专利申请系列号10/940,269和2005年3月11日提交的美国专利申请系列号11/077,664的优先权，它们各自的整个内容在这里引作参考。

　　简述本发明涉及被取代的杂环化合物、包含所述化合物的组合物和使用所述化合物和化合物组合物的方法。化合物和包含它们的组合物可以用于治疗疾病或疾病症状，包括由sirtuin(例如，SIRT1)介导的脱乙酰作用介导的那些。

　　在一个方面，本发明涉及治疗或预防对象的疾病(例如，本文所述的疾病)的方法。该方法包括，给对象施用有效量的具有式(I)的化合物

　　其中，R1和R2与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C5-C10杂芳基，它们中的每一个可以任选地被1-5个R5取代；或R1是H，S-烷基，或S-芳基，且R2是氨基烷基，其中氮被烷基、芳基或芳基烷基取代，它们中的每一个任选地进一步被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代；R3和R4与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C5-C10杂芳基，它们中的每一个可以任选地被1-5个R6取代；每个R5和R6独立地是卤素，羟基，C1-C10烷基，C1-C6卤代烷基，C1-C10烷氧基，C1-C6卤代烷氧基，C6-C10芳基，C5-C10杂芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12杂芳烷基，C3-C8杂环基，C2-C12链烯基，C2-C12炔基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，羧基，羧酸盐(酯)，氰基，硝基，氨基，C1-C6烷基氨基，C1-C6二烷基氨基，巯基，SO3H，硫酸盐(酯)，S(O)NH2，S(O)2NH2，磷酸盐(酯)，C1-C4亚烷二氧基，氧代，酰基，氨基羰基，C1-C6烷基氨基羰基，C1-C6二烷基氨基羰基，C1-C10烷氧基羰基，C1-C10硫代烷氧基羰基，肼基羰基，C1-C6烷基肼基羰基，C1-C6二烷基肼基羰基，羟基氨基羰基；烷氧基氨基羰基；或R5或R6之一和R7形成含有4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的环状基团，其可以任选地被氧或C1-C6烷基取代；X是NR7，O，或S；Y是NR7’，O或S；----代表任选的双键；

　　R7和R7’各自独立地是氢，C1-C6烷基，C7-C12芳基烷基，C7-C12杂芳基烷基；或R7与R5或R6之一形成含有4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的环状基团，其可以任选地被氧或C1-C6烷基取代；且n是0或1。

　　X可以是NR7且Y可以是NR7’。R7和R7’可以各自是，例如，氢或CH3。R7和R7’之一可以是氢，且另一个可以是CH3。

　　R1和R2可以形成C5-C10环烯基，其可以被R5取代，且R3和R4可以形成C6-C10芳基，其可以被R6取代。

　　在某些实施方案中，环烯基双键可以在结合R1的碳和结合R2的碳之间。C5-C10环烯基，例如，C6或C7环烯基，可以被R5取代，且C6-C10芳基可以被R6取代。

　　R6可以是卤素(例如，氟或溴)，C1-C6烷基(例如，CH3)，C1-C6卤代烷基(例如，CF3)或C1-C6卤代烷氧基(例如，OCF3)。R5可以是例如，被取代基取代的C1-C6烷基，所述取代基例如氨基取代基；或氨基羰基(例如被取代的氨基羰基，其被取代基例如芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、烷氧基羰基或其它取代基取代。在每种情况下，取代基可以进一步被其它取代基取代)。

　　R1和R2可以形成C5-C10环烯基，其可以被R5取代，且R3和R4可以形成C6-C10芳基，其可以被R6取代。

　　在某些实施方案中，环烯基双键可以在结合R1的碳和结合R2的碳之间。C5-C10环烯基，例如，C6或C7环烯基，可以被R5取代，和C6-C10芳基可以被R6取代。

　　R6可以是卤素(例如，氯)，C1-C6烷基(例如，CH3)，C1-C6卤代烷基(例如，CF3)或C1-C6卤代烷氧基(例如，OCF3)。R5可以是氨基羰基。

　　R1和R2可以形成C5-C10环烯基，其可以被R5取代，且R3和R4可以形成C6-C10芳基，其可以被R6取代。

　　在某些实施方案中，环烯基双键可以在结合R1的碳和结合R2的碳之间。C5-C10环烯基，例如，C6或C7环烯基，可以被R5取代，且C6-C10芳基可以被R6取代。这些化合物可以具有式(II)或式(III) R6可以是卤素(例如，氟或溴)，C1-C6烷基(例如，CH3)，C1-C6卤代烷基(例如，CF3)或C1-C6卤代烷氧基(例如，OCF3)。R5可以是氨基羰基。化合物可以是选自

　　在一个实例中，化合物可以是式(VI)的化合物，其具有高对映体过量的单一异构体，其中优势异构体的旋光度是负的，例如，-14.1(c＝0.33，DCM)或，例如，[α]D25-41.2°(c0.96，CH3OH)。在第二个实例中，化合物可以是式(IV)的化合物，其具有高对映体过量的单一异构体，其中优势异构体的旋光度是负的。在有些实例中，施用式(IV)，(V)，或(VII)的化合物，其具有高对映体过量的单一异构体，其中优势异构体具有与上面所示的星号碳相对应的式(VI)化合物的负异构体相同的绝对构型。

　　相对于非-SIRT1 sirtuin，该化合物可以优先抑制SIRT1，例如，至少1.5，2，5，或10倍优先。该化合物可以具有对SIRT1的Ki，其小于500，100，50，或40nM。

　　在有些实例中，化合物会降低FOXO转录因子(例如FoxO1或FoxO3)的活性。

　　量可以是能有效地改善疾病的至少一种症状。疾病或病症可以是，例如，年龄相关的疾病，老年疾病，具有年龄相关的易感性因素的疾病，肿瘤性疾病，非肿瘤性疾病，神经障碍，心血管疾病，代谢紊乱，皮肤病学的疾病，或皮肤病学的组织状况。在一个实施方案中，疾病或病症可以是神经变性疾病或病症，其中神经变性疾病可以至少部分地由多谷氨酰胺聚集介导，例如，亨廷顿氏舞蹈病，脊延髓肌萎缩(SBMA或肯尼迪氏病)，齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(DRPLA)，脊髓小脑性共济失调1(SCA1)，脊髓小脑性共济失调2(SCA2)，Machado-Joseph病(MJD；SCA3)，脊髓小脑性共济失调6(SCA6)，脊髓小脑性共济失调7(SCA7)，和脊髓小脑性共济失调12(SCA12)。神经变性疾病可以是帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。

　　疾病或病症可以与sirtuin有关或至少部分地由其介导，例如，疾病或病症可以与sirtuin-介导的脱乙酰作用有关或至少部分地由其介导，例如，过度的sirtuin活性或过度水平的脱乙酰基的p53，FoxO1，或FoxO3。sirtuin可以是SIRT1，例如，人SIRT1。

　　疾病或病症可以是癌症。量可以是，例如，有效地减小癌症或肿瘤细胞块，转移风险，或肿瘤细胞生长的速度。量可以是有效地调节(例如，增加)细胞凋亡。

　　疾病或病症可以是代谢病，例如代谢综合征或糖尿病(例如，I型糖尿病或II型糖尿病)。量可以是，例如，有效地提高胰岛素敏感性，增加胰岛素分泌，或者其它方式或降低葡萄糖水平。在有些实例中，疾病或病症与代谢病有关，例如心脏疾病相关的糖尿病。

　　疾病或病症可以是脂肪相关的疾病例如肥胖症或血脂障碍或高脂血症。量可以是，例如，有效地降低对象的体重或预防对象的体重增加。

　　疾病或病症可以是神经障碍例如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。量可以是，例如，有效地减轻神经障碍的一种或多种症状。

　　方法可以包括，施用化合物不止一次，例如，重复施用化合物。可以在一次或多次快速推注或连续施用中，施用化合物。可以从外部(from without)(例如，通过注射，摄入，吸入等)或从内部例如通过植入装置，施用化合物。

　　量可以是有效地增加对象的至少有些细胞中的sirtuin底物(例如，白，例如，组蛋白或转录因子，例如，p53，FoxO1，或FoxO3)的乙酰化。

　　方法还可以包括，鉴别需要这样的治疗的对象，例如，通过评价对象细胞中的sirtuin活性，评价编码sirtuin的对象核酸中的核苷酸同一性，评价对象的赘生细胞或赘生生长(例如，肿瘤)，评价对象细胞(例如，肿瘤活组织检查)中的遗传组成或基因表达。

　　方法还可以包括，监测对象，例如，将对象成像，评价对象中的肿瘤大小，评价对象细胞中的sirtuin活性，评价对象中的副作用，例如，肾功能。

　　在另一个方面，本发明涉及抑制sirtuin-介导的底物(例如FoxO转录因子)的脱乙酰作用的方法。该方法包括，使sirtuin接触式(I)化合物。抑制可以发生在体外、无细胞的培养基中、细胞培养物中或生物体中，例如，哺乳动物，优选人。

　　在另一个方面，本发明涉及评价多种化合物的方法，该方法包括a)提供包含许多化合物的化合物文库，每种化合物具有式(I)；和b)对于来自该文库的许多化合物中的每一种，i)使化合物接触sirtuin测试蛋白，其包含sirtuin的功能性脱乙酰基酶结构域；和ii)评价在有化合物存在下，化合物和sirtuin测试蛋白之间的相互作用。

　　实施方案可以包括下述的一种或多种在一个实施方案中，评价化合物和sirtuin测试蛋白之间的相互作用包括，评价sirtuin测试蛋白的酶活性。

　　在一个实施方案中，评价化合物和sirtuin测试蛋白之间的相互作用包括，评价化合物和sirtuin测试蛋白之间的结合相互作用。

　　方法还可以包括，基于评价的结果，选择能调节对底物的脱乙酰基酶活性的化合物。底物可以是乙酰化的赖氨酸氨基酸，乙酰化的转录因子(例如，p53，FoxO1，或FoxO3)或它们的乙酰化的肽，乙酰化的组蛋白或它们的乙酰化的肽。

　　方法还可以包括，基于评价的结果，选择能调节对底物的sirtuin脱乙酰基酶活性的化合物。

　　在一个方面，本发明涉及一种缀合物，其包括靶向试剂和化合物，其中靶向试剂和化合物共价连接，且化合物具有式(I)。

　　靶向试剂可以是抗体，例如，对细胞表面蛋白(例如，癌症-特异性的抗原)特异性的抗体。

　　在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包括本文所述化合物，和关于治疗本文所述疾病的使用说明书。试剂盒还可以包括印刷材料，其包含化合物的名称、结构的描述。

　　在另一个方面，本发明涉及分析或设计结构的方法，该方法包括提供计算机-产生的本文所述化合物(例如，式I化合物)的图像或结构(优选地三维图像或结构)，提供计算机-产生的第二种化合物(例如，另一种本文所述的化合物(例如，式I化合物，NAD)或靶物(例如，sirtuin(例如，人sirtuin，例如，SIRT1，SIRT2，SIRT3，SIRT4，SIRT5，SIRT6，或SIRT7))，或非靶分子(off-target molecule)(例如，SIRT1以外的sirtuin，例如，SIRT2或SIRT3，或非-sirtuin组蛋白脱乙酰基酶))的图像或结构(优选地三维图像或结构)；和对比第一种和第二种化合物的结构，例如，对比结构，例如，与键角有关的参数，分子间或分子内距离，原子或基团的位置；例如，第一代或第二代化合物-预测的化合物与靶物或非靶分子相互作用或抑制它们的能力。

　　在一个优选的实施方案中，进一步在体外、体内或计算机地(insilico)用靶物或非靶分子评价结构。

　　在另一个方面，本发明涉及数据库，其包括关于或鉴定结构的信息，关于结构的活性的信息，例如，体外，体内或计算机地，例如，至少5，10，50，或100个记录。

　　在一个方面，本发明涉及数据库，其包括许多记录，每个记录具有a)关于或鉴定具有本文所述的结构(例如，式I的结构)的化合物的信息；和b)关于患者的参数的信息，该参数与肿瘤性疾病或神经变性疾病有关，例如患者参数。

　　在一个方面，本发明涉及评价化合物的方法，该方法包括提供具有式I结构的第一种化合物，或具有关于结构的信息的数据记录；提供具有式I结构或不具有式I结构的第二种化合物，或具有关于结构的信息的数据记录；评价第一种化合物和第二种化合物，例如，体内，体外，或计算机地；和对比第二种化合物与第一种化合物与sirtuin(例如，SIRT1)相互作用(例如，抑制sirtuin)的能力，从而评价第二种化合物与SIRT1相互作用的能力。

　　在其它方面，本发明涉及组合物，其包含本文任一式的化合物，和药学上可接受的载体。组合物可以含有其它治疗剂，例如，抗肿瘤剂或神经变性疾病药剂。这样的组合物在生产用于前述用途的药物中的应用，也在本发明的范围内。

　　在另一个方面，本发明是治疗或预防对象中特征在于不希望的细胞增殖的疾病(例如，癌症，例如，依赖于p53的癌症或独立于p53的癌症)的方法。该方法包括，施用SIRT1拮抗剂。例如，SIRT1拮抗剂可以是下述的一种或多种SIRT1的反义，RNAi，抗体，细胞内抗体，和通过本文所述的方法鉴别出的其它化合物，例如，诱导SIRT1表达细胞的细胞凋亡的化合物。

　　在一个优选的实施方案中，该方法包括，与一种或多种治疗剂(例如，用于治疗不希望的细胞增殖的治疗剂或药剂)联合施用SIRT1拮抗剂。治疗剂包括，例如以下一种或多种化疗剂，放射性同位素，和细胞毒素。化疗剂的实例包括紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，白消安，顺铂，多柔比星，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光辉霉素，苯丁酸氮芥，吉西他滨，放线菌素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，，嘌呤霉素，maytansinoid和其类似物或同系物。其它治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥，塞替派，苯丁酸氮芥，CC-1065，美法仑，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链唑霉素，丝裂霉素C，和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称作道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，更生菌素(以前称作放线菌素)，博来霉素，光辉霉素，和氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱，长春碱，紫杉酚和maytansinoid)。放射性同位素可以包括α，β和/或γ放射体。放射性同位素的实例包括212Bi，213Bi，131I，211At，186Re，90Y和117Lu。

　　包装产品也在本发明的范围内。包装产品包括容器，在容器中的前述化合物之一，和与容器相伴随的指示施用化合物来治疗本文所述的病症(例如，癌症或神经变性疾病)、疾病或疾病症状(包括本文所述的那些)的标识(例如，标签或插页)。

　　对象可以是哺乳动物，优选人。对象也可以是非-人对象，例如，动物模型。在某些实施方案中，方法还可以包括鉴别对象。鉴别需要这样的治疗的对象，可以是对象或保健人员的判断，且可以是主观的(例如，意见)或客观的(例如，通过测试或诊断方法可测量的)。

　　术语“哺乳动物”包括生物体，其包括小鼠，大鼠，牛，绵羊，猪，兔子，山羊，和马，猴子，狗，猫，且优选人。

　　术语“治疗”或“治疗的”指向对象施用本文所述的化合物，其目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、治疗、改善、提高或影响疾病，例如，感染，疾病的症状或向疾病的倾向。

　　上述化合物的有效量范围可以是约0.1mg/Kg至约500mg/Kg，或者约1至约50mg/Kg。有效剂量也可以随给药途径、以及与其它试剂共同使用的可能性而变化。

　　术语“烷基”指含指示数目的碳原子的直链或支链的烃链。例如，C1-C12烷基表示该基团中可具有1-12(含两端值)个碳原子。术语“卤代烷基”指其中一个或多个氢原子被卤素替代的烷基，且包括其中所有氢都已经被卤素替代的烷基(例如，全氟烷基)。术语“芳基烷基”或“芳烷基”指其中烷基氢原子被芳基替代的烷基。芳烷基包括其中超过一个氢原子已经被芳基替代的基团。“芳基烷基”或“芳烷基”的实例包括苄基，2-苯乙基，3-苯丙基，9-芴基，二苯甲基，和三苯甲基。

　　术语“链烯基”指含有2-12个碳原子且具有一个或多个双键的直链或支链的烃链。链烯基的实例包括但不限于，烯丙基，丙烯基，2-丁烯基，3-己烯基和3-辛烯基。双键碳之一可以任选地是链烯基取代基的附着点。术语“炔基”指含有2-12个碳原子且特征在于具有一个或多个三键的直链或支链的烃链。炔基的实例包括但不限于，乙炔基，丙炔基，和3-己炔基。三键碳之一可以任选地是炔基取代基的附着点。

　　术语“烷基氨基”和“二烷基氨基”分别指-NH(烷基)和-NH(烷基)2。术语“芳烷基氨基”指-NH(芳烷基)。术语“烷基氨基烷基”指(烷基)NH-烷基-；术语“二烷基氨基烷基”指(烷基)2N-烷基-。术语“烷氧基”指-O-烷基。术语“巯基”指SH。术语“硫代烷氧基”指-S-烷基。术语”硫代芳基氧”指-S-芳基。

　　术语“芳基”指芳族单环、二环或三环烃环系统，其中能发生取代的任意环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。芳基的实例包括但不限于，苯基，萘基，和蒽基。

　　如本文使用的术语“环烷基”包括具有3至12个碳的饱和环状、二环、三环或多环烃基。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。环烷基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。环烷基的实例包括但不限于，环丙基，环己基，甲基环己基，金刚烷基，和降冰片烷基。

　　术语“杂环基”指非芳族3-10元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果分别是单环、双环、或三环，则为碳原子和1-3、1-6、或1-9个N、O或S杂原子)。杂原子可以任选地是杂环基取代基的附着点。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。杂环基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。杂环基的实例包括但不限于，四氢呋喃基，四氢吡喃基，哌啶基，吗啉代，吡咯啉基，嘧啶基，喹啉基，和吡咯烷基。

　　术语“环烯基”指具有5至12个碳、优选地5至8个碳的部分饱和的非芳族的环状、双环、三环或多环烃基。不饱和的碳可以任选地是环烯基取代基的附着点。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。环烯基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。环烯基的实例包括但不限于，环己烯基，环己二烯基，或降冰片烯基。

　　术语“杂环烯基”指部分饱和的非芳族5-10元单环、8-12元双环、或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N、或S(例如，如果分别是单环、双环、或三环，则为碳原子和1-3、1-6、或1-9个N、O或S杂原子)。不饱和的碳或杂原子可以任选地是杂环烯基取代基的附着点。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。杂环烯基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。杂环烯基的实例包括但不限于，四氢吡啶基和二氢吡喃基。

　　术语“杂芳基”指芳族5-8元单环、8-12元双环、或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N、或S(例如，如果分别是单环、双环、或三环，则为碳原子和1-3、1-6、或1-9个N、O或S杂原子)。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。

　　术语“氧代”指氧原子，当结合碳时，它形成羰基，当结合氮时，它形成N-氧化物，且当结合硫时，它形成亚砜或砜。

　　术语“酰基”指烷基羰基，环烷基羰基，芳基羰基，杂环基羰基，或杂芳基羰基取代基，其中的任一个可以被进一步取代(例如，被一个或多个取代基取代)。

　　术语“氨基羰基，”烷氧基羰基，”肼基羰基，和羟基氨基羰基分别指基团-C(O)NH2，-C(O)O(烷基)，-C(O)NHNH2，和-C(O)NHOH。

　　术语“取代基”指在烷基、环烷基、链烯基、炔基、杂环基、杂环烯基、环烯基、芳基或杂芳基的任意原子上“取代”的基团。任意的原子可以被取代。合适的取代基包括但不限于，烷基(例如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10，C11，C12直链或支链的烷基)，环烷基，卤代烷基(例如，全氟烷基例如CF3)，芳基，杂芳基，芳烷基，杂芳烷基，杂环基，链烯基，炔基，环烯基，杂环烯基，烷氧基，卤代烷氧基(例如，全氟烷氧基例如OCF3)、卤素，羟基，羧基，羧酸盐(酯)，氰基，硝基，氨基，烷基氨基，SO3H，硫酸盐(酯)，磷酸盐(酯)，亚甲二氧基(-O-CH2-O-，其中氧结合到邻位原子上)，亚乙二氧基，氧代，硫代(例如，C＝S)，亚胺基(烷基，芳基，芳烷基)，S(O)n烷基(其中n是0-2)，S(O)n芳基(其中n是0-2)，S(O)n杂芳基(其中n是0-2)，S(O)n杂环基(其中n是0-2)，胺(单-，二-，烷基，环烷基，芳烷基，杂芳烷基，芳基，杂芳基，和它们的组合)，酯(烷基，芳烷基，杂芳烷基，芳基，杂芳基)，酰胺(单-，二-，烷基，芳烷基，杂芳烷基，芳基，杂芳基，和它们的组合)，氨磺酰(单-，二-，烷基，芳烷基，杂芳烷基，和它们的组合)。在一个方面，基团上的取代基独立地是任一个单独的前述取代基，或前述取代基的任意子集。在另一个方面，取代基可以自己被任一个前述取代基取代。

　　在下面的附图和详述中，描述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从详述和附图以及权利要求中，可以明白本发明的其它特征、目的和优点。

　　本文引用的所有文献，无论是印刷的、电子的、计算机可读存储介质还是其它形式，都清楚地整体引作参考，包括但不限于摘要、文章、期刊、出版物、教科书、论文、因特网站、数据库、专利、专利申请和专利公开。

　　图2是计算机-产生的模型，其显示了结合在SIRT的活性部位的化合物8的一种可能的取向。

　　图3b是仅用依托泊苷或用依托泊苷和化合物8处理的NCI-H460细胞的蛋白印迹。

　　图6是描述与对映体8(+)相比化合物8的对映体8(-)优先抑制酵母sir2的图。

　　图7是描述化合物8抑制U2OS细胞和MCF-7细胞中的SirT1的有效性的凝胶测定。

　　图10是描述化合物8导致废除血清饥饿-介导的细胞周期抑制剂p27的上调的条形图。

　　详细描述示例性化合物的结构可以用于实践本发明的示例性化合物具有通式(I)，且含有被取代的5或6元环核心，后者分别含有1个或2个氧、氮或硫原子作为环的组成原子，例如，下式(I)中的X和Y。

　　任意的环碳原子可以被取代。例如，R1，R2，R3，和R4可以包括但不限于被取代的或未被取代的烷基，环烷基，链烯基，炔基，杂环基，杂环烯基，环烯基，芳基，杂芳基等。5或6元环核心可以是饱和的，即不含有双键，或部分或完全饱和的，即分别含有一个或两个双键。当n＝0时，“X”可以是氧、硫或氮，例如，NR7。取代基R7可以是，不限于，氢，烷基，例如，C1，C2，C3，C4烷基，SO2(芳基)，酰基，或环氮可以形成氨基甲酸酯或脲基的一部分。当n＝1时，X可以是NR7，O，或S；且Y可以是NR7’，O或S。X和Y可以是杂原子的任意组合，例如N，N，N，O，N，S，等。

　　式(I)化合物的一个优选子集包括具有一个(或优选地2个)与5或6元环核心稠合的环的化合物，例如，R1和R2与它们结合的碳一起，和/或R3和R4与它们结合的碳一起，可以形成例如，C5-C10环烷基(例如，C5，C6，或C7)，C5-C10杂环基(例如，C5，C6，或C7)，C5-C10环烯基(例如，C5，C6，或C7)，C5-C10杂环烯基(例如，C5，C6，或C7)，C6-C10芳基(例如，C6，C8或C10)，或C6-C10杂芳基(例如，C5或C6)。稠合环组合可以包括但不限于下述的一种或多种

　　在某些实施方案中，当n是0且X是NR7时，氮取代基R7可以与含有例如4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的稠合环之一形成环状结构。该环状结构可以任选地被氧或C1-C6烷基取代。

　　本发明预见到的取代基和变量的组合，仅仅是会导致形成稳定的化合物的那些。如本文所使用的，术语“稳定的”指这样的化合物，其具有足以允许生产的稳定性，且其会将化合物的完整性维持足以用于本文所述目的(例如，治疗性或预防性地施用给对象)的时间段。

　　*具有指定为A的活性的化合物具有小于1.0μM的IC50。具有指定为B的活性的化合物具有1.0μM至10.0μM的IC50。具有指定为C的活性的化合物具有大于10.0μM的IC50。指定为D的化合物在该测定中未测试。

　　通过体外(基于细胞的和基于非细胞的)和体内方法，可以鉴别出可以用于实现本发明的化合物。在实施例中描述了这些方法的说明。

　　方案1 溴化的β-酮酯1可以与4-氯苯胺缩合，随后环化可以产生吲哚2。酯皂化可以产生酸3。最后与PyAOP氨基化，可以产生酰胺4。其它方法是本领域已知的，参见，例如，美国专利3,859,304，美国专利3,769,298，J.Am.Chem.Soc.1974，74，5495。上面的合成可以延伸到其它苯胺，例如，3，5-二氯苯胺，3-氯苯胺，和4-溴苯胺。使用N-取代的苯胺，例如，4-氯-N-甲基苯胺，可以得到区域异构的产物，例如，5。

　　本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，从而作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单独的非对映体和非对映体混合物存在。这些化合物的所有这样的异构体形式，都清楚地包含在本发明中。本发明的化合物也可以含有可限制键旋转的连接(例如，碳-碳键)或取代基，例如由于环或双键的存在引起的限制。因此，所有顺式/反式和E/Z异构体都清楚地包含在本发明中。本发明的化合物还可以多种互变异构形式表示，在这样的情况下，本发明清楚地包括本文所述化合物的所有互变异构形式，即使可能只表示了一种互变异构形式(例如，环系统的烷基化可能导致多个位点的烷基化，本发明清楚地包括所有这样的反应产物)。这样的化合物的所有这样的异构形式都清楚地包括赞本发明中。本文所述化合物的所有晶形都清楚地包括在本发明中。

　　可用于分离异构体(例如，立体异构体)的技术，属于本领域的常识，且记载在Eliel，E.L.；Wilen，S.H.；Mander，L.N.Stereochemistry of Organic Compounds，Wiley Interscience，NY，1994。例如，通过形成非对映体盐，例如用手性碱，例如，(+)或(-)α-甲基苄基胺，或通过使用手性柱的高效液相色谱，可以将化合物3或4拆分成高对映体过量(例如，60％，70％，80％，85％，90％，95％，99％或更大)。在有些实施方案中，直接在手性柱上纯化粗产物4，提供对映体富集的化合物。

　　在有些实例中，施用本文公开的化合物，其中一种异构体(例如，R异构体或S异构体)以高对映体过量存在。通常，与具有+32.8(c＝0.38，DCM)或[α]D25+22.72°(c0.910，CH3OH)的正旋光度的对映体相比，具有负旋光度(例如，-14.1(c＝0.33，DCM)或[α]D25-41.18°(c0.960，CH3OH))的化合物4的异构体具有更大的针对SirT1酶的活性。因此，在有些实例中，有利地向对象施用具有高对映体过量的具有负旋光度的异构体的化合物4，来治疗疾病。

　　尽管化合物4的对映体提供了立体异构体的一个实例，也预见到其它立体异构体，例如如下面的化合物6和7所述。

　　如同式4的化合物，在有些情况下，有利地向对象施用具有比它的对映体更大的对SirT1的亲和力的化合物6或7的异构体。例如，在有些实例中，有利地施用富集(-)旋光异构体的化合物7，其中酰胺(或其它取代基)具有与化合物4的负异构体相同的构型。

　　在有些实例中，有利地施用具有下述结构之一的化合物，其中酰胺(或其它取代基)的立体化学结构与具有负旋光度的化合物4中的酰胺相符。

　　(n是0至4的整数)本发明的化合物包括化合物本身，以及它们的盐和它们的前药(如果适用)。盐，例如，可以在阴离子和本文所述化合物上的带正电荷的取代基(例如，氨基)之间形成。合适的阴离子包括氯离子，溴离子，碘离子，硫酸根，硝酸根，磷酸根，柠檬酸根，甲磺酸根，三氟乙酸根，和乙酸根。类似地，盐也可以在阳离子和本文所述化合物上的带负电荷的取代基(例如，羧酸根)之间形成。合适的阳离子包括钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，和铵阳离子，例如四甲基铵离子。前药的实例包括酯和其它药学上可接受的衍生物，其在施用给对象后，能提供活性化合物。

　　可通过附属合适的官能团而修饰本发明的化合物，从而提高所选择的生物学性质，例如靶向特定组织。这样的修饰是本领域已知的，且包括能增加向给定生物学区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)中的生物学渗透、增加口服利用度、增加溶解度以允许注射给药、改变代谢和改变排泄速率的那些。

　　在一个备选实施方案中，本文所述的化合物可以用作平台或支架，其可以用于组合化学技术中，用于制备化合物的衍生物和/或化学文库。化合物的这种衍生物和文库具有生物活性，且可用于鉴别和设计具有特定活性的化合物。适合使用本文所述化合物的组合技术是本领域已知的，其示例为Obrecht，D.和Villalgrodo，J.M.，Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis ofSmall-Molecular-Weight Compounds Libraries，Pergamon-ElsevierScience Limited(1998)，且包括下述的那些，例如″split和pool″或″平行″合成技术，固相和溶液相技术，和编码技术(参见，例如，Czarnik，A.W.，Curr.Opin.Chem.Bio.，(1997)1，60。因而，一个实施方案涉及使用本文所述化合物产生衍生物或化学文库的方法，包括1)提供包含许多孔的物体；2)在每个孔中提供通过本文所述方法鉴别出的一种或多种化合物；3)在每个孔中提供另外一种或多种化合物；4)从每个孔分离所得到的一种或多种产物。一个备选实施方案涉及使用本文所述的化合物产生衍生物或化学文库的方法，包括1)提供附着到固体支持物上的一种或多种本文所述的化合物；2)用一种或多种另外的化学试剂处理通过本文所述方法鉴别出的附着到固体支持物上的一种或多种化合物；3)从固体支持物分离所得到的一种或多种产物。在上述方法中，″标签″或标识符或标记部分可以附着到和/或脱离本文所述的化合物或它们的衍生物，以促进对目标产物或它们的中间体的跟踪、识别或分离。这样的部分是本领域已知的。在前述方法中使用的化学试剂可以包括，例如，溶剂，试剂，催化剂，保护基和去保护基试剂等。这样的化学试剂的实例是在本文参考的各种合成和保护基化学教科书和论文中出现的那些。

　　示例性哺乳动物sirtuin包括SIRT1，SIRT2，和SIRT3，例如，人SIRT1，SIRT2，和SIRT3。本文所述的化合物可以抑制哺乳动物sirtuin(例如，SIRT1，SIRT2，或SIRT3)的一种或多种活性，例如，其Ki小于500，200，100，50，或40nM。例如，化合物可以抑制脱乙酰基酶活性，例如，对于天然的或人工的底物，例如，本文所述的底物，例如，如下。

　　SIRT1的天然底物包括组蛋白，p53，和FoxO转录因子例如FoxO1和FoxO3。SIRT1蛋白可结合许多其它蛋白，它们称作“SIRT1结合伴侣”。例如，SIRT1结合p53，并在p53途径中起作用，例如，p53的K370，K371，K372，K381，和/或K382，或包括这些赖氨酸中的一个或多个的肽。例如，肽的长度可以是5至15个氨基酸。SIRT1蛋白也可以使组蛋白脱乙酰化。例如，SIRT1可以使组蛋白H3或包含这些赖氨酸中的一个或多个的小肽的赖氨酸9或14脱乙酰化。组蛋白脱乙酰作用会改变局部的染色质结构，从而可以调节附近的基因的转录。许多SIRT1结合伴侣是转录因子，例如，识别特定的DNA位点的蛋白。例如，SirT1会使叉头蛋白(即FoxO蛋白)脱乙酰化并下调。SIRT1和SIRT1结合伴侣之间的相互作用可以向基因组的特定区域递送SIRT1，并可以导致底物(例如，定位于该特定区域的组蛋白和转录因子)的局部显现。

　　SIRT2的天然底物包括微管蛋白，例如，α-微管蛋白。参见，例如，North et al.Mol Cell.2003 Feb；11(2)437-44。示例性的底物包括包含α-微管蛋白的赖氨酸40的肽。

　　术语“SIRT1蛋白”和“SIRT1多肽”在本文中可互换地使用，且指与250氨基酸保守的SIRT1催化结构域(SEQ ID NO1的氨基酸残基258至451)至少25％相同的多肽。SEQ ID NO1描述了人SIRT1的氨基酸序列。在优选的实施方案中，SIRT1多肽可以与SEQ ID NO1、或SEQ ID NO1的氨基酸残基258至451之间的氨基酸序列具有至少30，40，50，60，70，80，85，90，95，99％同源性。在其它实施方案中，SIRT1多肽可以是片段，例如，能实现下述一项或多项的SIRT1片段在NAD和/或NAD类似物存在下，脱乙酰化底物，且能结合靶蛋白，例如，转录因子。可以评价这样的功能，例如，通过本文所述的方法。在其它实施方案中，SIRT1多肽可以是“全长”SIRT1多肽。如本文所使用的术语“全长”指至少具有天然存在的SIRT1多肽(或本文所述的其它蛋白)的长度的多肽。“全长”SIRT1多肽或其片段也可以包括其它序列，例如，纯化标记，或其它附着的化合物，例如，附着的荧光团，或辅因子。相对于天然存在的Sir2家族成员，术语“SIRT1多肽”也可以包括包含一个或多个置换(例如，1至10个置换)的序列或变体。“SIRT1活性”指SIRT1的一种或多种活性，例如，底物(例如，氨基酸，肽，或蛋白)的脱乙酰作用，底物例如转录因子(例如，p53)或组蛋白蛋白(例如，在辅因子例如NAD和/或NAD类似物存在下)，和向靶物(例如，靶蛋白，例如，转录因子)的结合。

　　如本文所使用的，蛋白的“生物活性部分”或“功能结构域”包括目标蛋白的参与相互作用的片段，所述相互作用例如分子内或分子间的相互作用，例如，结合或催化相互作用。分子间相互作用可以是特定的结合相互作用或酶促相互作用(例如，相互作用可以是瞬时的，和形成或破坏共价键)。分子间相互作用可以是在蛋白和另一种蛋白之间，蛋白和另一种化合物之间，或蛋白的第一种分子和第二种分子之间(例如，二聚化相互作用)。蛋白的生物活性部分/功能结构域包括这样的肽，其包含与蛋白的氨基酸序列足够同源或源自它的氨基酸序列，所述蛋白包含比全长天然蛋白少的氨基酸，且表现出天然蛋白的至少一种活性。通过多种技术，包括截短分析、定点诱变和蛋白水解，可以鉴别出生物活性部分/功能结构域。通过适当的生物化学或生物学(例如，遗传学)测定，可以测定突变体或蛋白水解片段的活性。在有些实施方案中，功能结构域独立地折叠。典型地，生物活性部分包含具有蛋白(例如，SIRT1)的至少一种活性的结构域或基序。示例性结构域是SIRT1核心催化结构域。蛋白的生物活性部分/功能结构域可以是长度为例如10，25，50，100，200或更多个氨基酸的多肽。蛋白的生物活性部分/功能结构域可以用作开发调节SIRT1的试剂的靶物。

　　体外测定在有些实施方案中，可以在体外测定与SIRT1的相互作用，例如，结合。反应混合物可以包括SIRT1辅因子例如NAD和/或NAD类似物。

　　在其它实施方案中，反应混合物可以包括SIRT1结合伴侣，例如，转录因子，例如，p53或p53以外的转录因子，例如FoxO1或FoxO3，且可以筛选化合物，例如，在体外测定中，以评价实验化合物的调节SIRT1和SIRT1结合伴侣(例如，转录因子)之间的相互作用的能力。例如，通过使组分之一偶联放射性同位素或酶标记，使得可以通过检测复合物中的标记化合物来确定标记的组分向另一组分的结合，可以完成这类测定。组分可以直接或间接地标有125I，35S，14C，或3H，且通过直接计数放射性发射或闪烁计数法，检测放射性同位素。或者，组分可以用例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，或萤光素酶进行酶标记，且通过确定适当的底物向产物的转化，检测酶标记。也可以使用竞争测定来评价实验化合物和靶物之间的物理相互作用。

　　无细胞的测定包含，在足以允许2种组分相互作用和结合的条件下和时间内，制备靶蛋白(例如，SIRT1)和实验化合物的反应混合物，从而形成可以去除和/或检测的复合物。

　　也可以检测2种分子之间的相互作用，例如，使用荧光测定，其中至少一种分子被荧光标记。这样的测定的一个实例包括荧光能量转移(FET，或荧光共振能量转移即FRET)(参见，例如，Lakowicz et al.，美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos，et al.，美国专利No.4,868,103)。选择第一种‘供体’分子上的荧光团标记，使得它发射的荧光能量会被第二种‘受体’分子上的荧光标记吸收，后者由于吸收的能量，又能发荧光。或者，‘供体’蛋白分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能。选择能发射不同波长光的标记，使得‘受体’分子标记可以与‘供体’的标记区分开。由于标记之间的能量转移的效率与分子之间的距离有关，可以评估分子之间的空间关系。在结合发生在分子之间的情况下，测定中的‘受体’分子标记的荧光发射应当是最大的。通过本领域熟知的标准的荧光检测方法(例如，使用荧光计)，可以方便地测量FET结合事件。

　　在另一个实施方案中，使用实时生物分子相互作用分析(BIA)(参见，例如，Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345和Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)，可以测定SIRT1蛋白结合靶分子的能力。″表面等离子共振″或“BIA”实时检测生物特异性的相互作用，无需标记任何相互作用物(例如，BIAcore)。结合表面处的质量变化(指示着结合事件)会导致表面附近的光折射率的变化(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，产生可检测的信号，其可以用作生物分子之间的实时反应的指示。

　　在一个实施方案中，将SIRT1锚定在固相上。可以在反应(例如，结合反应)结束时检测锚定在固相上的SIRT1/实验化合物复合物。例如，可以将SIRT1锚定在固体表面上，且可以用本文所讨论的可检测的标记，直接或间接地标记实验化合物(其未被锚定)。

　　可能需要固定化SIRT1或抗-SIRT1抗体，以促进复合形式的与未复合形式的蛋白之一或两者分离，以及适应测定的自动化。可以在适合容纳反应物的任何容器中，在有和没有候选化合物存在下，完成实验化合物向SIRT1蛋白的结合，或SIRT1蛋白与第二种组分的相互作用。这样的容器的实例包括微量滴定板，试管，和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，其添加允许蛋白之一或两者向基质结合的结构域。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/SIRT1融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠子(SigmaChemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其然后与实验化合物或实验化合物和未吸附的靶蛋白或SIRT1蛋白合并，并在有助于复合物形成的条件下(例如，在盐和pH的生理条件下)温育混合物。温育后，洗涤珠子或微量滴定板孔，以去除任何未结合的组分，在珠子的情况下基质固定化，直接或间接测定复合物，例如，如上所述。或者，复合物可以从基质解离，并使用标准的技术，测定SIRT1结合或活性的水平。

　　将SIRT1蛋白或靶分子固定化到基质上的其它技术包括，使用生物素和链霉抗生物素的缀合。使用本领域已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的SIRT1蛋白或靶分子，并固定化在链霉抗生物素-包被的96孔平板(Pierce Chemical)的孔中。

　　为了进行测定，将未固定化的组分加到含有锚定的组分的包被的表面。反应完成后，在能使形成的任何复合物保持固定化在固体表面上的条件下，去除未反应的组分(例如，通过洗涤)。可以以许多方式，检测锚定在固体表面上的复合物。在预先标记先前未固定化的组分的情况下，检测到固定化在表面上的标记，指示着复合物的形成。在没有预先标记先前未固定化的组分的情况下，可以使用间接标记来检测锚定在表面上的复合物，例如，使用对固定化的组分特异性的标记的抗体(该抗体又可以被直接地或间接地用例如标记的抗-Ig抗体来标记)。

　　在一个实施方案中，使用会与SIRT1蛋白或靶分子反应、但是不会妨碍SIRT1蛋白向它的靶分子结合的抗体，进行该测定。可以将这样的抗体衍生到平板的孔中，并通过抗体缀合，将未结合的靶物或SIRT1蛋白捕获到孔中。除了上面关于GST-固定化的复合物所述的那些方法以外，检测这样的复合物的方法还包括，使用可与SIRT1蛋白或靶分子反应的抗体进行复合物的免疫检测，以及依赖于检测与SIRT1蛋白或靶分子有关的酶活性的酶联测定。

　　在一个优选的实施方案中，测定包括，使SIRT1蛋白或其生物活性部分接触会结合SIRT1的已知化合物，形成测定混合物，使测定混合物接触实验化合物，并确定实验化合物与SIRT1蛋白相互作用的能力，其中确定实验化合物与SIRT1蛋白相互作用的能力包括确定实验化合物与已知化合物相比优先结合SIRT1或其生物活性部分、或调节靶分子的活性的能力。

　　示例性测定方法包括1536孔格式的SirT1酶测定，它是基于Biomol的商业的“Fluor-de-Lys”测定原理，它是产生荧光的(。在该测定中，将赖氨酰残基的e-氨基官能团的脱乙酰作用与产生荧光的“显色”步骤相偶联，后者依赖于未封闭的e-氨基官能团，并产生发荧光的氨基甲基香豆素。可以在商业的肉眼检查读数器上读出荧光。

　　其它测定使用下述疾病或病症的模型系统之一，或本文所述疾病或病症的其它已知模型，也可以评价本文所述的化合物或化合物的文库。

　　用于评价实验化合物对肌肉萎缩的作用的模型包括，例如，1)去神经导致的大鼠腓肠肌内侧头质量损失，例如，通过在大腿中部割断右坐骨神经；2)固定化导致的大鼠腓肠肌内侧头质量损失，例如，通过以90度弯曲固定右踝关节；3)后肢悬挂导致的大鼠腓肠肌内侧头质量损失；(参见，例如，U.S.)；4)用恶病质的细胞因子白介素-1(IL-1)处理导致的骨骼肌萎缩ney，S.R.Kimball，T.C.Vary，Shock 7，1-16(1997))；和5)用糖皮质激素处理导致的骨骼肌萎缩(A.L.Goldberg，J Biol Chem 244，3223-9(1969))。模型1，2，和3包括通过改变神经活性和/或肌肉经历的外部负荷至不同的程度而诱导产生肌肉萎缩。模型4和5诱导萎缩而不直接影响这些参数MS(实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))，例如，如Goverman et al.，Cell.72551-60(1993)所述，和如Brok etal.，Immunol.Rev.，183173-85(2001)所综述的灵长类动物模型。

　　结构-活性关系和基于结构的设计。还可能使用结构-活性关系(SAR)和基于结构的设计原理来生成与sirtuin相互作用(例如，拮抗或激动sirtuin)的化合物。SAR会提供关于相关化合物在至少一个相关测定中的活性的信息。建立目标化合物的结构特征和活性之间的关联。例如，可能通过评价与本文所述化合物有关的化合物家族的SAR，以鉴别激动剂活性所需的一个或多个结构特征。然后，可以化学地生产改变这些特征的化合物文库。在另一个实施例中，生产预测会相互作用的单一化合物，并体外或体内地评价。

　　基于结构的设计可以包括，确定sirtuin的功能结构域和化合物的物理相互作用的结构模型。结构模型可以指示如何改造化合物，例如，以改善相互作用或减少不利的相互作用。可以鉴别化合物与sirtuin的相互作用，例如，通过晶体结构的解析，NMR，或基于计算机的建模，例如，对接方法。参见，例如，Ewing et al.J Comput AidedMol Des.2001 May；15(5)411-28.

　　SAR和基于结构的设计方案，以及其它方法，都可以用于鉴别药效团。将药效团定义为化学基团的独特的三维(3D)排列。这样的基团的选择，可能有利于生物活性。由于药学活性的分子必须与对象体内的一种或多种分子结构相互作用以便有效，且分子的目标功能性质源自这些相互作用，每种活性化合物必须含有化学基团的独特排列，其能使该相互作用发生。通常称作描述中心的化学基团可以表示为(a)原子或原子组；(b)伪-原子，例如环的中心，或分子的质心；(c)向量，例如原子对，孤电子对方向，或平面的垂直线。一旦阐述，药效团可以用于搜索化学化合物的数据库，例如，具有与药效团相容的结构的那些。参见，例如，U.S.6,343,257；Y.C.Martin，3D DatabaseSearching in Drug Design，.Chem.35，2145(1992)；和A.C.Good和J.S.Mason，Three Dimensional Database Searches，Reviews in Comp.Chem.7，67(1996)。数据库搜索查询不仅基于化学性质信息，还基于准确的几何信息。

　　一旦鉴别出与药效团相匹配的化合物，可以体外、体内或计算机地测试它的活性，例如，向sirtuin或其结构域的结合。

　　在一个实施方案中，可以修饰作为激动剂或候选激动剂的化合物，例如，在Nature.2003 Sep 11；425(6954)191-196中所述的化合物，以鉴别拮抗剂，例如，使用本文所述的方法。例如，可以制备相关化合物的文库，并可以在本文所述的测定中，筛选文库。

　　本发明化合物的药学上可接受的盐包括源自药学上可接受的无机和有机酸和碱的那些。合适的酸盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐、pectinate、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。其它酸，例如草酸，尽管它们本身不是药学上可接受的，也可以用于制备用作得到本发明化合物和它们的药学上可接受的酸加成盐的中间体的盐。源自合适碱的盐包括，碱金属(例如，钠)盐、碱土金属(例如，镁)盐、铵盐和N-(烷基)4+盐。本发明还预期了本文公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。通过这样的季铵化，可得到水或油-可溶的或可分散的产物。本文任一式的化合物的盐形式可以是羧基的氨基酸盐(例如L-精氨酸，-赖氨酸，-组氨酸盐)。

　　本文所述式的化合物可例如通过注射、静脉内、动脉内、真皮下、腹膜内、肌内、或皮下给药；或口服、口含、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药，剂量为约0.5至约100mg/kg体重，或者剂量为1mg至1000mg/剂，每4至120小时，或按照特定化合物的要求。本文所述方法预期了施用有效量的化合物或化合物的组合物，以得到所需或指明的作用。典型地，本发明的药物组合物每天约1至约6次给药。或者，作为连续输注。这样的给药可用作慢性或急性治疗。可与载体物质组合生产单一剂型的活性成分的量，根据所治疗的宿主和特定的给药模式而变化。典型的制剂含有约5％至约95％活性化合物(w/w)。或者，这样的制剂含有约20％至约80％活性化合物。

　　可能需要比上面列举那些更低或更高的剂量。任何特定患者的具体剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、疾病、状况或症状的严重程度和病程、患者对疾病、状况或症状的处置、和治疗医师的判断。

　　患者的情况改善后，如果需要，可施用维持剂量的本发明的化合物、组合物或组合。随后，当症状已经减轻到希望的水平时，随症状而异，可减少给药的剂量或频率或两者，达到保持改善的情况的水平。然而，在疾病症状的任何反复时，患者可能需要在长期基础上间歇治疗。

　　本文所述组合物包含本文所述式的化合物以及其它治疗剂(如果存在)，其量能有效地实现对疾病或疾病症状的调节，包括本文所述的那些。

　　术语“药学上可接受的载体或辅剂”指可与本发明化合物一起施用给患者的载体或辅剂，且当以足以递送治疗量的化合物的剂量给药时，不会破坏其药理学活性且无毒。

　　可用于本发明药物组合物中的药学上可接受的载体、辅剂和赋形剂包括，但不限于，离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化的药物递送系统(SEDDS)如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，用于药物剂型中的表面活性剂如吐温或其它类似的聚合物递送基质，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。环糊精如α-、β-和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精，或其它可溶解的衍生物，也可有利地用于提高本文所述式的化合物的递送。

　　本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、口含、经或通过植入的贮器给药，优选地通过口服给药或通过注射给药。本发明的药物组合物可以含有任何常规的无毒的药学上可接受的载体、辅剂和赋形剂。在有些情况下，可用药学上可接受的酸、碱或缓冲液调节制剂的pH，从而提高所配制化合物或其递送形式的稳定性。本文所用术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内和颅内注射或输注技术。

　　药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如，无菌可注射水性或油质悬浮液。该悬浮液可按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂(如，例如，吐温80)和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的赋形剂和溶剂有甘露糖醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油可常规地用作溶剂或混悬介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物，适用于制备注射制剂，如同天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，特别是以它们的聚氧乙基化的形式。这些油溶液或悬浮液还可包含长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或常用于药学上可接受的剂型(如乳液和/或悬浮液)的配制中的类似分散剂。通常用于生产药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用的表面活性剂如吐温或司盘和/或其它相似的乳化剂或生物利用度增强剂，也可用于配制的目的。

　　本发明的药物组合物可以任何口服可接受的剂型口服给药，所述剂型包括，但不限于，胶囊剂、片剂、乳液和含水悬浮液、分散体和溶液。就口服使用的片剂而言，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式口服给药来说，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用含水悬浮液和/或乳液时，可将活性成分混悬或溶于油相中，其可与乳化剂和/或混悬剂混合。如果需要，可加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

　　本发明的药物组合物还可以以直肠给药的栓剂形式施用。通过将本发明化合物与合适的无刺激的赋形剂混合，可以制备这些组合物，所述赋形剂在室温是固体，但在直肠温度是液体，因此会在直肠中融化，从而释放活性组分。这类材料包括，但不限于，可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

　　当期望的治疗包含局部应用可容易地接近的区域或器官时，本发明的药物组合物的局部给药是有用的。就局部应用于皮肤而言，应当将药物组合物配制成含有混悬或溶解于载体中的活性组分的合适软膏剂。用于局部施用本发明的化合物的载体包括但不限于，矿物油，液体石油，白石油，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。或者，可以将药物组合物配制成合适的洗剂或乳膏，其含有用合适的乳化剂混悬或溶解于载体中的活性化合物。合适的载体包括但不限于，矿物油，脱水山梨醇单硬脂酸酯，聚山梨醇酯60，十六烷基酯蜡，鲸蜡醇(cetearyl alcohol)，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。通过直肠栓剂或合适的灌肠剂，也可以将本发明的药物组合物局部地应用于下肠道。局部透皮贴剂也包含在本发明中。

　　本发明的药物组合物可通过鼻气雾剂或吸入给药。这样的组合物可根据制药领域熟知的技术制备，且可在盐水中制备成溶液，其中使用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂。

　　使用可植入的装置，可以施用具有本文式的化合物和另外的试剂(例如，治疗剂)的组合物。可植入的装置和有关的技术是本领域已知的，在需要连续或定时释放地递送本文所述化合物或组合物时，可用作递送系统。另外，可植入装置递送系统可用于靶向化合物或组合物递送的特定位点(例如，局限的位点，器官)Negrin et al.，Biomaterials，22(6)563(2001)。在本发明中也可以使用包含替代性的递送方法的定时释放技术。例如，基于聚合物技术、持续释放技术和包封技术(例如，聚合物，脂质体)的定时释放制剂，也可以用于递送本文所述的化合物和组合物。

　　用于递送本文的活性化疗组合的贴剂，也在本发明范围内。贴剂包括材料层(例如，聚合物，布，纱布，绷带)和本文所述的本文式的化合物。材料层的一侧可以具有粘附到它上面的保护层，以阻止化合物或组合物的通过。贴剂可以另外包括粘合剂，以将贴剂保持在对象上。粘合剂是一种组合物，包括天然或合成来源的那些，当接触对象的皮肤时，其会暂时粘附到皮肤上。它可以是防水的。粘合剂可以位于贴剂上，以使它保持接触对象的皮肤较长的时间段。粘合剂可以由粘性或粘附强度构成，所以它会将装置保持在经受偶然接触的位置，但是，依赖于正面作用(例如，拉开，剥离，或其它故意的移动)，粘合剂屈从于施加于装置或粘合剂本身上的外部压力，并允许破坏粘附接触。粘合剂可以是压力敏感的，也就是说，允许通过将压力(例如，推，摩擦)施加于粘合剂或装置上，将粘合剂(和要粘附到皮肤上的装置)定位在皮肤上。

　　当本发明组合物包含本文所述式的化合物和一种或多种附加治疗剂或预防剂的组合时，化合物和附加试剂均应以单一疗法方案中通常施用剂量的约1-100％，且更优选约5-95％的剂量水平存在。附加试剂可以作为多次给药方案的一部分，与本发明化合物分开地给药。或者，那些试剂可以是单一剂型的一部分，与本发明化合物共同混合于单一组合物中。

　　肿瘤性疾病本发明的化合物可以用于治疗癌症。如本文所使用的，术语“癌症”、“过度增殖的”、“恶性的”和“肿瘤的”可互换地使用，指特征在于快速增殖或赘生物的那些细胞、异常状态或状况。该术语包括所有类型的癌性生长或致癌的过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭阶段。“病理性过度增殖的”细胞发生在特征在于恶性肿瘤生长的疾病状态中。

　　术语“瘤形成”的一般医学含义指“新细胞生长”，其作为丧失对正常生长控制的反应而产生，例如指赘生细胞生长。“增生”指经历异常高速度的生长的细胞。但是，如本文所使用的，术语“瘤形成”和“增生”可以互换地使用，如它们的上下文所揭示的，概括地指经历异常的细胞生长速度的细胞。瘤形成和增生包括“肿瘤”，其可以是良性的、恶化前的或恶性的。

　　癌性疾病的实例包括，但不限于，实体瘤、软组织肿瘤、和转移性病损。实体瘤的实例包括恶性肿瘤，例如各种器官系统的肉瘤、腺癌、和癌，如影响肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如，结肠)、和泌尿生殖道(例如，肾、泌尿道上皮细胞)、咽、前列腺、卵巢的那些以及腺癌，其包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌、小肠癌等。也可使用本文所述的化合物治疗或预防前述癌症的转移性病变。

　　主题方法可以用于治疗各种器官系统的恶性肿瘤，如影响肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)和泌尿生殖道、前列腺、卵巢、咽的那些，以及腺癌，其包括恶性肿瘤如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。可治疗的示例性实体瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、状癌、状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

　　术语“癌”是本领域技术人员公认的，且指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织形成的那些。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤性组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”指来源于腺组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。

　　主题方法也可以用于抑制造血来源(例如，源于髓系、淋巴系或红细胞系)的增生/赘生细胞或其前体细胞的增殖。例如，本发明预见到各种髓细胞性疾病的治疗，包括但不限于，急性前髓细胞白血病(APML)、急性髓细胞白血病(AML)和慢性髓细胞白血病(CML)(综述见Vaickus，Oncol./Hemotol.11267-97)。可通过主题方法治疗的淋巴样恶性肿瘤包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B-系ALL和T-系ALL；慢性淋巴细胞白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其它形式包括，但不限于，非何杰金氏淋巴瘤及其变型、外周T-细胞淋巴瘤、成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)及何杰金氏病。

　　阿尔茨海默氏病阿尔茨海默氏病(AD)是一种复杂的神经变性病，其会导致神经元的不可逆的丧失，且是具有至少部分地由蛋白聚集造成的症状的神经变性疾病的一个实例。本文所述的化合物可以用于改善具有AD的对象的至少一种症状。

　　阿尔茨海默氏病的临床标志包括记忆、判断、对物理环境的定向和语言的进行性缺损。AD的神经病理学标志包括区域-特异性的神经元丧失、淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结。淀粉样蛋白斑是含有β淀粉样蛋白肽(也称作Aβ，或Aβ42)的细胞外斑块，所述肽是β-淀粉样蛋白前体蛋白(也称作APP)的切割产物。神经原纤维缠结是由异常地高度磷酸化的微管-相关蛋白tau的纤丝组成的不溶的细胞内聚集体。淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结可能有助于通过细胞凋亡导致神经元丧失的继发事件(Clark和Karlawish，Ann.Intern.Med.138(5)400-410(2003)。例如，β-淀粉样蛋白会诱导培养的神经元的半胱天冬酶-2-依赖性的细胞凋亡(Troy et al.J.Neurosci.20(4)1386-1392)。体内斑的沉积可能以类似的方式触发邻近的神经元的细胞凋亡。

　　编码APP、早老素-1和早老素-2的基因的突变，已经参与早发AD(Lendon et al.JAMA 227825(1997))。已经证实这些蛋白的突变会通过产生Aβ的细胞内途径，促进APP的蛋白酶解加工。Aβ加工的异常调节，可能对形成淀粉样蛋白斑和随后的与斑有关的神经元损伤是重要的。

　　可以使用多种标准来评价对象中的AD，包括遗传的、生物化学的、生理的和认知的标准。AD的症状和诊断是医学工作人员已知的。下面描述了AD的有些示例性的症状和标记。可以使用关于这些指征和已知与AD有关的其它指征的信息作为“AD-相关的参数”。AD-相关的参数可以包括定性的或定量的信息。定量信息的一个实例是一个或多个方面的数值，例如，蛋白的浓度或数字减影血管造影图。定性信息可以包括评定，例如，医生的评定或二元(“是”/“否”)等。AD-相关的参数包括指示对象未被确诊AD或不具有AD的特定指征的信息，例如，不是AD典型的认知测试结果，或与AD无关的遗传APOE多态性。

　　渐进性认知缺损是AD的标志。该缺损可以表现为记忆、判断、作出决定、对物理环境的定向和语言的衰退(Nussbaum和Ellis，New Eng.J.Med.348(14)1356-1364(2003))。其它形式的痴呆的排除，可以辅助诊断AD。

　　神经元死亡会导致AD患者的进行性脑萎缩。成像技术(例如，磁共振成像，或计算机x线体层摄影术)可以用于检测脑中AD-相关的损伤和/或脑萎缩。

　　例如，可以使用抗体、其它免疫球蛋白和其它特异性的结合配体来检测生物分子，例如，与AD有关的蛋白或其它抗原。例如，可以使用一种或多种特异性的抗体来探测样品。多种格式是可行的，例如，ELISA，基于荧光的测定，蛋白印迹，和蛋白阵列。生产多肽阵列的方法，记载在文献中，例如，De Wildt et al.(2000).Nature Biotech.18，989-994；Lueking et al.(1999).Anal.Biochem.270，103-111；Ge，H.(2000).Nucleic Acids Res.28，e3，I-VII；MacBeath，G.，和Schreiber，S.L.(2000).Science 289，1760-1763；和WO99/51773A1。使用质谱、色谱、电泳、酶相互作用，或使用检测翻译后修饰(例如，磷酸化，遍在蛋白化，糖基化，甲基化，或乙酰化)的探针，也可以分析蛋白。

　　可以检测来自对象的细胞中的核酸表达，例如，通过手术、提取、死后或其它取样(例如，血液，CSF)得到。可以评价一个或多个基因的表达，例如，通过基于杂交的技术，例如，RNA分析，RT-PCR，SAGE，和核酸阵列。核酸阵列可用于描绘样品中的多个mRNA种类。核酸阵列可以通过多种方法产生，例如，通过光刻方法(参见，例如，美国专利号5,143,854；5,510,270；和5,527,681)，机械方法(例如，如美国专利号5,384,261所述的定向流方法)，基于针的方法(例如，如美国专利号5,288,514所述)，和基于珠子的技术(例如，如PCTUS/93/04145所述)。

　　通过多种方式，包括酶联测定，使用标记的前体，和核磁共振(NMR)，可以检测与AD有关的代谢产物。例如，NMR可以用于确定样品中基于磷酸盐的化合物的相对浓度，例如，肌酸水平。也可以检测其它代谢参数，例如氧化还原状态，离子浓度(例如，Ca2+)(例如，使用离子敏感的染料)，和膜电势(例如，使用膜片箝技术)。

　　关于AD-相关的标记的信息可以记录和/或储存在计算机可读格式中。典型地，将信息与关于对象的参照相联系，且也与关于在对象中编码sirtuin的基因中的一个或多个核苷酸的同一性的信息相关联(直接地或间接地)。

　　在一个实施方案中，使用AD的非-人动物模型(例如，小鼠模型)，例如，评价例如本文所述化合物或化合物的治疗方案。例如，US 6,509,515描述了一种这样的模型动物，其天然地能用于学习和记忆测试。该动物在脑组织中以一定的水平表达淀粉样蛋白前体蛋白(APP)序列，使得动物在出生后较短的时间段内发生进行性神经学疾病，通常在出生后一年内，优选地在出生后2至6个月内。将APP蛋白序列导入动物，或处于胚胎期的动物前身，优选地在单细胞或受精的卵母细胞阶段，通常不迟于约8-细胞阶段。合子或胚胎然后在伪怀孕的养育雌性中发育至足月。将淀粉样蛋白前体蛋白基因导入动物胚胎，以便染色体整合成一种状态，其导致淀粉样蛋白前体蛋白的超内源表达和进行性神经学疾病在脑皮质边缘区域发生，该脑区域在进行性神经学疾病状态(例如AD)中受到显著影响。受影响的转基因动物中的神经胶质瘤病和临床表现模拟神经学疾病。神经学疾病的进展方面的特征在于，减少的探测和/或运动行为和减少的2-脱氧葡萄糖摄入/利用和脑皮质边缘区域的肥大性神经胶质瘤病。另外，观察到的变化类似于在有些衰老动物中观察到的变化。其它动物模型也记载在US5,387,742；5,877,399；6,358,752；和6,187,992。

　　帕金森氏病帕金森氏病包括黑质中的多巴胺能神经元的神经变性，其导致调节运动功能的黑质纹状体多巴胺系统的变性。该病理又导致运动功能障碍(参见，例如，Lotharius et al.，Nat.Rev.Neurosci.，3932-42(2002))。示例性的运动症状包括运动不能，弯腰，步履艰难，姿势不稳定，僵住，肌肉强直，和震颤。示例性非运动症状包括抑郁，缺少动力，被动，痴呆和胃肠功能紊乱(参见，例如，Fahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.，9911-14(2003)和Pfeiffer，LancetNeurol.，2107-16(2003))。已经在0.5-1％的65至69岁的人和1-3％80岁和更老的人中，观察到帕金森氏病(参见，例如，Nussbaum etal.，N.Engl.J.Med.，3481356-64(2003))。

　　评价多谷氨酰胺聚集许多种无细胞的测定、基于细胞的测定和生物体测定可以用于评价多谷氨酰胺聚集，例如，亨廷顿多谷氨酰胺聚集。有些实例记载在，例如，U.S.。

　　测定(例如，无细胞的，基于细胞的，或生物体的)可以包括报道蛋白，其包含具有至少35个多谷氨酰胺的多谷氨酰胺重复区。报道蛋白可以是容易检测的，例如，通过荧光。例如，蛋白缀合到荧光团上，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(PE)，多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)，Texas Red，Cy3，Cy5，Cy7，或荧光共振能量串联荧光团例如PerCP-Cy5.5，PE-Cy5，PE-Cy5.5，PE-Cy7，PE-Texas Red，和APC-Cy7。在另一个实例中，蛋白是″内在荧光的″，即它具有完全由它的氨基酸序列编码的发色团，且可以在不需要辅因子或底物的情况下发荧光。例如，该蛋白可以包括绿色荧光蛋白(GFP)-样发色团。如本文所使用的，″GFP-样发色团″指内在荧光的蛋白部分，其包含具有一个中心α-螺旋的11-链β-桶，该中心α-螺旋具有缀合的π-共振系统，其包括2个芳族环系统和它们之间的桥。

　　在一个实施方案中，包含具有至少35个多谷氨酰胺的多谷氨酰胺重复区的报道蛋白用于基于细胞的测定中。

　　在一个实例中，可以使用PC12神经元细胞系，其具有改造成表达由HD基因外显子1编码的蛋白的构建体，所述外显子1含有融合到增强的GFP(绿色荧光蛋白)基因上的交替的重复密码子。参见，例如，Boado et al.J.Pharmacol.And Experimental Therapeutics 295(1)239-243(2000)和Kazantsev et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611404-09(1999)。该基因的表达，会导致共同定位到蛋白聚集物部位的绿色荧光的出现。HD基因外显子1-GFP融合基因是在muristerone调节的诱导型启动子的控制下。一个具体的构建体具有约46个谷氨酰胺重复(由CAA或CAG编码)。其它构建体具有，例如，103个谷氨酰胺重复。PC12细胞生长在DMEM，5％马血清(热灭活的)，2.5％FBS和1％ Pen-Strep，且小量维持在Zeocin和G418上。以5×105细胞/ml培养基的密度，将细胞平板接种在包被有聚-L-赖氨酸盖玻片的24-孔平板中，无任何选择。过夜培养后，加入muristerone，以诱导HD基因外显子1-GFP的表达。可以使细胞接触实验化合物，例如，在平板接种之前或之后，和在诱导之前或之后。可以在配备了Zeiss 510 LSM共焦显微镜和相干氪氩激光器和氦氖激光器的Zeiss倒置100MAxioskop上，获取数据。可以将样品装载到Lab-Tek II分室的用于提高成像的盖玻片系统中。在独立的实验(例如，至少3个或7个独立的实验)中，计数在物镜视野内的亨廷顿蛋白-GFP聚集的数目。

　　用于评价样品的其它示例性方式包括高流通量装置，例如Amersham Biosciences IN细胞分析系统和CellomicsTMArrayScanHCS系统，其允许静态地和动态地检测和定量荧光标记的部分的亚细胞定位和浓度。也参见，美国专利号5,989,835。

　　其它示例性哺乳动物细胞系包括CHO细胞系和293细胞系。例如，具有整合拷贝的HD基因外显子1(其具有大约103Q重复，后者与GFP相融。