疾病的治米乐M6官网登录入口疗方法pdf
发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A61K 31/58申请公布日:20120530专利申请权的转移IPC(主分类):A61K 31/58变更事项:申请人变更前权利人:DMI采集公司变更后权利人:安皮奥制药股份有限公司变更事项:地址变更前权利人:美国科罗拉多州变更后权利人:美国科罗拉多州登记生效日:20140217实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/58申请日:20100622公开
本发明提供在有需要的动物中抑制血管通透性过高的方法。该方法包括向所述动物给药血管-通透性过高-抑制量的达那唑化合物。本发明还提供调节动物中内皮细胞细胞骨架的方法。所述方法包括向动物给药有效量的达那唑化合物。
1： 一种在有需要的动物中抑制血管通透性过高的方法， 其包括向所述动物给药血 管 - 通透性过高 - 抑制量的达那唑化合物。
2： 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述动物因为存在由血管通透性过高引起的疾 病或病症而需要达那唑化合物。
3： 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 一旦诊断出所述疾病或病症， 立即开始给药达那 唑化合物。
5： 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 所述疾病或病症为动脉粥样硬化。
7： 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 所述疾病或病症为急性肺损伤、 急性呼吸窘迫综 合征， 老化相关性黄斑变性、 脑水肿、 脉络膜水肿、 脉络膜炎、 冠状微血管疾病、 脑微血管疾 病、 伊尔斯氏病、 由损伤引起的水肿、 与高血压相关的水肿、 血管小球的血管泄露、 失血性休 克、 欧文 - 加斯综合征、 缺血、 黄斑水肿、 肾炎、 肾病、 肾病水肿、 肾病综合征、 神经病、 组织水 肿引起的器官衰竭、 先兆子痫， 肺水肿、 肺高血压、 肾功能衰竭、 视网膜水肿、 视网膜出血、 视 网膜静脉阻塞、 视网膜炎、 视网膜病变、 无症状性脑梗死、 全身炎症反应综合征、 移植肾肾小 球病、 葡萄膜炎、 血管泄露综合征、 玻璃体出血或 Von Hipple Lindau 病。
8： 根据权利要求 7 所述的方法， 其中， 所述疾病或病症为黄斑水肿。
10： 根据权利要求 7 所述的方法， 其中， 所述疾病或病症为视网膜病。
11： 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 所述疾病或病症为糖尿病的血管并发症。
12： 根据权利要求 11 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为水肿、 低密度脂蛋白在内皮 下空间聚集、 加速的动脉粥样硬化、 脑血管壁的加速老化、 心肌水肿、 心肌纤维化、 舒张期功 能障碍、 糖尿病性心肌病、 在患糖尿病的母亲中胎儿肺部发育的滞后、 一种或多种肺部生理 学参数的变化、 感染敏感性增加、 肠系膜中的血管增生、 糖尿病性神经病变、 糖尿病性黄斑 水肿、 糖尿病性肾病、 糖尿病性视网膜病、 以及皮肤的发红、 变色、 干燥和溃疡。
13： 根据权利要求 12 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为水肿。
14： 根据权利要求 12 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为糖尿病性心肌病。
15： 根据权利要求 12 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为糖尿病性神经病变。
16： 根据权利要求 12 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为糖尿病性黄斑水肿。
17： 根据权利要求 12 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为糖尿病性视网膜病。
18： 根据权利要求 17 所述的方法， 其中， 所述糖尿病性视网膜病为非增生性糖尿病性 视网膜病。
19： 根据权利要求 12 所述的方法， 其中， 所述血管并发症为糖尿病性肾病。
20： 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述动物因有一种或多种发生由血管通透性过 高引起的疾病或病症的早期表现或倾向， 而需要达那唑化合物。
21： 根据权利要求 20 所述的方法， 其中， 所述疾病或病症为糖尿病、 高血压或动脉粥样 硬化。
22： 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述血管通透性过高是下述部位或下述部位周 围发现的连续性内皮的血管通透性过高， 所述部位为 ： 脑、 膈、 十二指肠、 脂肪、 心脏、 肾脏、 2 大血管、 肺部、 肠系膜、 神经、 视网膜、 骨骼肌、 皮肤或睾丸。
23： 根据权利要求 22 所述的方法， 其中， 在下述部位或下述部位周围发现所述连续性 内皮， 所述部位为 ： 脑、 心脏、 肺部、 神经或视网膜。
24： 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述血管通透性过高是在下述部位或下述部位 周围发现的开窗内皮的血管通透性过高， 所述部位为 ： 肾脏、 胰脏、 肾上腺、 内分泌腺或肠。
25： 根据权利要求 24 所述的方法， 其中， 在肾脏中发现开窗内皮。
26： 根据权利要求 1 ～ 25 中任一项所述的方法， 其中， 所述达那唑化合物是达那唑。
27： 根据权利要求 1 ～ 26 中任一项所述的方法， 其中， 所述达那唑化合物口服给药。
28： 根据权利要求 1 ～ 27 中任一项所述的方法， 其中， 所述动物是人。
29： 根据权利要求 28 所述的方法， 其中， 所述血管 - 通透性过高 - 抑制量是每天 1ng ～ 100mg 达那唑化合物。
30： 根据权利要求 29 所述的方法， 其中， 所述血管 - 通透性过高 - 抑制量是每天 1mg ～ 100mg 达那唑化合物。
31： 根据权利要求 30 所述的方法， 其中， 所述血管 - 通透性过高 - 抑制量是每天 10mg ～ 90mg 达那唑化合物。
32： 一种调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法， 其包括向动物给药有效量的达那唑 化合物。
33： 根据权利要求 32 所述的方法， 其中， 所述调节细胞骨架包括抑制肌动蛋白张力丝 形成。
34： 根据权利要求 32 所述的方法， 其中， 所述调节细胞骨架包括引起、 增加或延长皮质 肌动蛋白环的形成。
35： 根据权利要求 32 所述的方法， 其中， 所述调节细胞骨架包括抑制 RhoA。
本发明要求 2009 年 6 月 22 日提交的临时申请 61/219,185 和 2010 年 3 月 18 日 提交的临时申请 61/315,350 的优先权， 并且在此将它们的全部公开内容引入作为参考。发明领域
本发明涉及抑制血管通透性过高 (vascular hyperpermeability) 以及由其导致 的水肿 ( 其它不良作用的方法。本发明还涉及调节内皮细胞的细胞骨架的方法。两种方法 包括向动物给药达那唑 (Danazo1) 化合物。 背景技术 血管内皮位于所有血管内部。其作为血液与组织和器官的界面。内皮形成半渗透 屏障其保持血液隔室的完整性， 但是允许水、 离子、 小分子、 大分子和细胞以经调节的方式 通过。该过程的失调将导致血管渗漏到皮下组织中。渗漏到组织中的液体会引起水肿， 其 在多种疾病中可以引起严重且危及生命的后果。 因此， 非常需要用于减少水肿， 尤其是在水 肿的最早期阶段减少水肿， 以及生理学上恢复内皮屏障的方法。
发明内容 本发明提供这样的方法。具体地， 本发明提供抑制血管通透性过高以及由其导致 的水肿和其它不良作用的方法。本方法包括向有此需要的动物给药血管 - 通透性过高 - 抑 制量的达那唑化合物。本发明的抑制血管通透性过高包括抑制细胞旁途径 - 引起的通透性 过高以及转胞吞作用 - 引起的通透性过高。近期的证据显示转胞吞作用 - 引起的通透性过 高是多种疾病和病况中最终导致组织和器官的损害过程中的第一步。因此， 本发明提供这 些疾病和病况中的早期介入手段， 其可以减少、 延迟或甚至最终阻止在这些疾病和病况中 组织和器官的损害。
本发明还提供调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法。 本方法包括向动物给药有 效量的达那唑化合物。
在本文中使用的 “血管通透性过高” 表示与基础水平相比， 血管内皮的通透性升 高。在本文中使用的 “血管通透性过高” 包括细胞旁途径 - 引起的通透性过高和转胞吞作 用 - 引起的通透性过高。
在本文中使用的 “细胞旁途径 - 引起的通透性过高” 表示由细胞旁途径运输引起 的与基础水平相比升高的血管通透性过高。 ” 细胞旁途径 - 引起的通透性过高” 的其它特征 如下文所述。
在本文中使用的 “细胞旁途径运输 (paracellular transport)” 表示离子、 分子和 液体通过内皮的内皮细胞之间的内皮细胞间连接 (IEJ) 而移动。
在本文中使用的 “转胞吞作用 - 引起的通透性过高” 表示由转胞吞作用引起的与 基础水平相比升高的血管通透性过高。
在本文中使用的 “转胞吞作用 (transcytosis)” 表示大分子以及相伴的液相血浆
成分跨越内皮的内皮细胞的主动转运。 “转胞吞作用” 的其它特征如下文所述。
当动物目前具有由血管通透性过高介导的疾病或病症、 显示出这类疾病或病症的 早期症状、 或者具有发展这类疾病或病症的倾向时， 该动物 “需要” 本发明的治疗。
在本文中使用的 “介导 (mediated)” 及类似术语表示由血管通透性过高引起、 引起 血管通透性过高、 涉及血管通透性过高、 或者因血管通透性过高而加重。 附图说明 图 1 显示在 HUVEC 细胞与达那唑保温之后检测的 OD 水平， 其作为达那唑抑制内皮 细胞初期增殖能力的量度标准。
图 3 显示在用达那唑处理 HUVEC 细胞之后检测的荧光， 其作为达那唑阻止内皮细 胞入侵的能力的量度标准。
内皮是控制从血液到组织实质的分子交换的重要看门人。其在很大程度上控制 具体的血管床到血源性分子 (blood-borne molecule) 的渗透。内皮细胞屏障的渗透性 和选择性主要取决于不同血管床中的微脉管系统内的内皮的结构和类型。不同器官的微 血管床内的内皮细胞显示出结构上的分化， 其可以被分成三个主要的形态学类型 ： 窦状型 (sinusoidal)、 开窗型 (fenestrated) 和连续型。
窦状内皮 ( 也称为 “不连续内皮” ) 具有大的细胞间和细胞内间隙 (gap) 并且无 基底膜， 其允许受到最小限度限制的从毛细血管腔到组织及从组织到毛细血管腔的分子运 输。在肝脏、 脾脏和骨髓中发现了窦状内皮。
开窗内皮 (fenestrated endothelium) 的特征在于存在大量 60 ～ 80nm 直径的被 称为窗的圆形的跨细胞的开口。在需要小分子快速交换的组织和器官中发现开窗内皮， 包 括肾脏 ( 肾小球、 肾小管周围毛细血管和上行直小血管 (ascending vasa recta))、 胰脏、 肾 上腺、 内分泌腺和肠。 这些窗被细小的膈覆盖， 除了在发育成熟的、 健康的肾小球中的那些。 参考 Ichimura 等人， J.Am.Soc.Nephrol.， 19 ： 1463-1471(2008)。
连续性内皮不含有窗或大的间隙。相反地， 连续性内皮的特征在于未被中断的内 皮细胞单层。体内的大部分内皮为连续性内皮， 且连续性内皮被发现位于或围绕脑 ( 血脑 屏障 )、 膈、 十二指肠、 脂肪、 心脏、 肾脏的一些区域 ( 乳突微脉管系统、 下行直小血管 )、 大血 管、 肺部、 肠系膜、 神经、 视网膜 ( 血视网膜屏障 )、 骨骼肌、 睾丸和身体的其它组织和器官。
连续性内皮中的内皮运输随细胞旁途径和跨细胞的途径出现被认为是一种常识。 细胞旁途径是在内皮细胞之间， 通过内皮细胞间连接 (IEJ) 的途径。在未受干扰的连续性 内皮中， 通过扩散和对流来实现水、 离子和小分子的细胞旁途径运输。大量水 ( 最多 40％ ) 也通过被称为水通道的水 - 运输膜通道跨细胞地跨越内皮细胞屏障。大量刺激可以破坏 IEJ 组织， 从而打开内皮屏障中的间隙。 这些细胞间间隙的形成允许液体、 离子、 大分子 ( 例
如蛋白质 ) 和其它血浆成分以不受限制的方式通过内皮细胞之间。这种细胞旁途径 - 引起 的通透性过高产生的水肿和其它不良作用能够最终导致组织和器官的损害。
跨细胞途径负责大分子跨过内皮细胞的主动转运， 所述大分子例如白蛋白和其它 血浆蛋白质， 是被称作 “转胞吞作用” 的过程。大分子的运输出现在被称作为细胞膜穴样 凹陷的小泡中。几乎所有的连续性内皮具有丰富的细胞膜穴样凹陷， 除了位于脑和睾丸 中的连续性内皮具有很少的细胞膜穴样凹陷。转胞吞作用是多步过程， 其涉及连续的来 自质膜的细胞膜穴样凹陷芽殖和裂变和跨细胞的易位， 以及随后的与相对质膜 (opposite plasmalemma) 的对接和融合， 在此细胞膜穴样凹陷通过胞吐作用向间质中释放它们的成 分。在正常的生理学条件下， 转胞吞作用是选择性的并且受到了严密的调控。
对于跨细胞途径的基础重要性的认识正在逐步深入。血浆蛋白质的转胞吞作用， 尤其是白蛋白 ( 其代表 65％的血浆蛋白质 ) 的转胞吞作用受到格外的关注因为其调节经血 管的血液渗透压梯度的能力。可以认识到， 随着增加的白蛋白和其它血浆蛋白质的转胞吞 作用高于基础水平， 会增加它们的组织蛋白质浓度， 随后会导致水移动跨过内皮屏障， 从而 产生水肿。
通过转胞吞作用也会运输低密度脂蛋白 (LDL) 跨过内皮细胞。在高脂血症中， 已 经通过检测 LDL 转胞吞作用的显著增加来作为动脉粥样硬化形成的初期事件。LDL 在内皮 下空间聚集， 并陷入在扩张的基底膜 (basal lamina) 的细胞外基质中。在高脂血症中内皮 下脂蛋白聚集， 随后的一连串事件会导致粥样斑块的形成。已有报道称早期的粥样硬化病 变有时会伴随 IEJ 的打开以及 LDL 和白蛋白大量不受控制的通过。
血管并发症是糖尿病的特点。在大血管水平， 动脉粥样硬化过程的加速往往表现 为疾病。 关于微血管病， 视网膜、 肾小球以及神经的微脉管系统的变化导致最多种的临床并 发症， 但是， 随着研究数量的持续增加， 显示糖尿病也会影响其它器官的微脉管系统， 例如 肠系膜、 皮肤、 骨骼肌、 心脏、 脑、 以及肺部， 导致另外的临床并发症。在所有这些血管床中， 血管通透性的改变可能代表了糖尿病内皮功能障碍的特点。
在连续性内皮中， 在糖尿病的早期， 对于血浆大分子毛细管的通透性过高被解释 为跨内皮的囊泡运输的强化 ( 即， 由增强转胞吞作用引起 ) 而不是 IEJ 的脱稳定化。此外， 已有报道称糖尿病患者的内皮细胞包括脑的那些， 含有与正常相比数量增加的细胞膜穴样 凹陷， 以及糖化的蛋白质、 尤其是糖化的白蛋白会被内皮细胞吸收， 并且以比它们天然形式 明显更快的速度进行胞转作用。此外， 增强的大分子转胞吞作用是会持续到超过糖尿病早 期阶段的过程， 并且如果不对该疾病进行治疗， 可能是导致糖尿病患者组织和器官水肿的 原因。该水肿随后导致组织和器官的损害。在高血压中也已经报道了大分子跨细胞运输的 类似的增加。
细胞旁途径 - 引起的通透性过高也是糖尿病和糖尿病血管并发症的原因。细胞旁 途径的 IEJ 包括粘着连接 (AJ) 和紧密连接 (TJ)。糖尿病改变在 AJ 和 TJ 两者中的特定蛋 白质的含量、 磷酸化和局限化， 从而促进增加的内皮屏障通透性。
通过转胞吞作用和细胞旁途径， 也会发生开窗内皮中的内皮运输。 此外， 借由窗发 生内皮运输。开窗内皮对于水和小亲水溶解物具有显著高的通透性， 这是因为窗的存在。
窗可能会或可能不会被膈所覆盖。具有带膈的窗 (diaphragmed fenestrae) 的内 皮的位置包括内分泌组织 ( 例如胰岛和肾上腺皮质 )、 胃肠粘膜以及肾脏的肾小管周围毛 细血管。 具有带膈的窗的开窗内皮的血浆蛋白质的通透性不会超过连续性内皮的血浆蛋白 质的通透性。 具有不带膈的窗的内皮的位置包括肾的肾小球。 血管小球的开窗内皮被延伸到窗 内的多糖包被覆盖 ( 形成所谓的 “可捕捉的塞子 (seive plug)” ) 以及被更为松散关联的 糖蛋白的内皮细胞表面层覆盖。 功能的选择通透性研究的数学分析已经确定血管小球的内 皮细胞多糖包被 ( 包括存在于窗中的 )， 以及与其关联的表面层占据循环中血浆白蛋白的 最多 95％的固位 (retention)。
已经发现血管小球内皮中的窗的损失与一些疾病中的蛋白尿相关， 这些疾病包括 糖尿病性肾病、 移植肾肾小球病、 先兆子痫、 糖尿病、 肾功能衰竭、 环孢霉素 A 肾病、 血清性 肾炎以及 Thy-1 肾炎。已经发现肌动蛋白重排， 以及尤其是张力丝 (stress fiber) 的解聚 对于窗的形成和保持是重要的。
通过转胞吞作用， 发生窦状内皮中的内皮运输， 且通过细胞间间隙 ( 内皮之间的狭 缝 ) 和细胞内间隙 ( 窗 )。 用肌动蛋白丝 - 断裂药物治疗窦状内皮可以引起间隙数量的显著 和快速的增加， 显示为对肌动蛋白细胞骨架内的内皮的孔隙率的调节。已经报道了其它细 胞骨架改变药物会改变窗的直径。因此， 窗 - 关联细胞骨架可能会控制在窦状内皮中内皮
本发明还提供抑制存在于含有开窗内皮或被开窗内皮围绕的任何组织和器官中 的血管通透性过高。如上所述， 开窗内皮存在于或围绕肾 ( 肾小球、 肾小管周围毛细血管和 上行直小血管 )、 胰脏、 肾上腺、 内分泌腺和肠。 优选， 开窗内皮是发现存在于肾中， 尤其是在 于肾的肾小球中的开窗内皮。
此外， 通过血管通透性过高引起的任何疾病或病症可以通过本发明的方法来治 疗。这样的疾病和病症包括糖尿病、 高血压和动脉粥样硬化。
尤其是糖尿病的血管并发症， 包括含有连续性内皮或开窗内皮的脑、 心脏、 肾脏、 肺部、 肠系膜、 神经、 视网膜、 骨骼肌、 皮肤以及其它组织和器官的血管并发症可以通过本发 明来治疗。这些血管并发症包括水肿、 LDL 在内皮下空间聚集、 加速的动脉粥样硬化、 以及 下述并发症 ： 脑 ( 血管壁的加速老化 )、 心脏 ( 心肌水肿、 心肌纤维化、 舒张期功能障碍、 糖 尿病性心肌病 )、 肾脏 ( 糖尿病性肾病 )、 肺部 ( 在患糖尿病的母亲中胎儿肺部发育的滞后、 一些肺部生理学参数的变化和感染敏感性的增加 )、 肠系膜 ( 血管增生 )、 神经 ( 糖尿病性 神经病变 )、 视网膜 ( 黄斑水肿和糖尿病性视网膜病 ) 和皮肤 ( 发红、 变色、 干燥和溃疡 )。
糖尿病性视网膜病是导致失明的主要原因， 其影响估计二千一百万患有糖尿病的 美国人中的约 25％。尽管其发病率和发展可以通过加强血糖和血压控制来降低， 但几乎所 有患有 1 型糖尿病的患者和超过 60％患有 2 型糖尿病的患者最终会发展成糖尿病性视网膜 病。糖尿病性视网膜病存在两个阶段。第一， 非增生性视网膜病变， 是该疾病的较早阶段且 其特征在于增加的血管通透性、 小动脉瘤、 水肿以及最终的血管闭塞。 新生血管不是非增生 性阶段的成分。在这个阶段的大部分视觉丧失是由于黄斑 ( 视网膜的中心区域 ) 中的液体
积累。这种液体积累被称为黄斑水肿并且可以导致暂时或永久的视力降低。糖尿病性视网 膜病的第二阶段被称为增生性视网膜病变， 且其特征在于异常新血管的形成。 不幸地是， 这 种异常新生血管可以是非常严重的损伤， 这是因为其可以引起眼部的出血、 视网膜瘢痕组 织、 糖尿病患者的视网膜剥离或青光眼， 这些中的任何均可以导致视力降低或失明。 黄斑水 肿也会出现在增殖阶段。
糖尿病性神经病变是糖尿病常见的严重的并发症。存在四种主要类型的糖 尿病性神经病变 ： 周围神经病变、 自主神经病变、 神经根神经丛病变 (radiculoplexus neuropathy) 以及单一神经病变。周围神经病变 ( 最常见的糖尿病性神经病变类型 ) 的 表现和症状包括 ： 麻木或感觉疼痛的能力降低、 或温度的变化 ( 尤其是脚部和脚趾 )、 麻刺 感或发烫感觉、 锐痛、 走路时的疼痛、 对于非常轻的接触极其敏感、 肌无力、 走路困难、 以及 严重的脚部问题 ( 例如溃烂、 感染、 变形以及骨和关节疼痛 )。自主神经病变影响自主神 经系统， 自米乐M6官网登录入口主神经系统控制心脏、 膀胱、 肺部、 胃、 肠、 性器官以及眼部， 这些区域中的任何部 分均可能出现问题。神经根神经丛病变 ( 也称为糖尿病肌萎缩、 股神经病或近端神经病变 (proximal neuropathy)) 通常影响臀部、 肩部或腹部的神经， 通常影响身体的一侧。 单一神 经病变是指仅损害一个神经， 通常是胳膊、 腿或面部的神经。 糖尿病性神经病变的常规并发 症包括四肢的丧失 ( 例如， 脚趾、 脚步或腿 )、 沙尔科关节 (charcot joint)、 尿路感染、 尿失 禁、 无知觉性低血糖 ( 甚至可能是致死的 )、 低血压、 消化问题 ( 例如， 便秘、 腹泻、 恶心以及 呕吐 )、 性功能障碍 ( 例如， 勃起功能障碍 )、 以及出汗增加或减少。可以看出， 症状可以从 轻微到疼痛、 到失去能力以及甚至是致死的。 糖尿病性肾病是在美国引起末期肾脏疾病的最普遍的原因。 其是糖尿病的血管并 发症， 影响肾脏的肾小球毛细血管并且降低肾脏的过滤能力。首先显示患有肾病的是超过 滤的出现， 以及随后的微量白蛋白尿。严重的蛋白尿和持续衰退的肾功能出现在末期肾脏 疾病之前。通常， 在肾病的任何表现出现之间， 通常忽视视网膜病变。对于由糖尿病引起的 末期肾脏疾病患者通常建议进行肾移植。 接受移植的患者 5 年存活率为约 60％， 相比地， 进 行透析的患者 5 年存活率仅为 2％。
高血压通常发展很多年， 并且其最终会影响几乎每个人。未受控制的高血压会增 加严重健康问题的风险， 所述严重健康问题包括 ： 心力衰竭、 充血性心力衰竭、 中风、 周围动 脉疾病、 肾衰竭、 动脉瘤、 眼部损伤、 以及在记忆或认知方面出现问题。
动脉粥样硬化也是逐渐发展的。 动脉粥样硬化能够影响冠状动脉、 颈动脉、 周围动 脉或微脉管系统， 动脉粥样硬化的并发症包括 ： 冠心病 ( 其可以引起心绞痛或心力衰竭 )、 冠状微血管疾病、 颈动脉疾病 ( 其可以引起短暂性脑缺血发作或中风 )、 周围动脉疾病 ( 其 可以引起对于热和冷的敏感度的丧失或甚至是组织死亡 )、 以及动脉瘤。
根据本发明可以治疗的其它疾病和病症包括 ： 急性肺损伤、 急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、 老化相关性黄斑变性、 脑水肿、 脉络膜水肿、 脉络膜炎、 冠状微血管疾病、 脑微血管 疾病、 伊尔斯氏病 (Eals disease)， 由损伤 ( 例如， 创伤或烧伤 ) 引起的水肿、 与高血压相关 的水肿、 血管小球的血管泄露、 失血性休克、 欧文 - 加斯综合征 (Irvine Gass Syndrome)、 缺血、 黄斑水肿 ( 例如， 由血管闭塞、 眼内手术后 ( 例如， 白内障手术 )、 葡萄膜炎或视网膜 色素变性引起， 以及由糖尿病引起的其它疾病 )、 肾炎 ( 例如， 肾小球肾炎、 血清病性肾炎以 及 Thy-1 肾炎 )、 肾病、 肾病水肿、 肾病综合征、 神经病、 组织水肿引起的器官衰竭 ( 例如， 在
败血病中或由创伤引起 )、 先兆子痫、 肺水肿、 肺高血压、 肾功能衰竭、 视网膜水肿、 视网膜出 血、 视网膜静脉阻塞 ( 例如， 分支或中心静脉阻塞 )、 视网膜炎、 视网膜病变 ( 例如， 动脉硬 化性视网膜病变、 高血压性视网膜病变、 放射性视网膜病变、 镰状红细胞性视网膜病变以及 早熟性视网膜病变， 以及其它糖尿病性视网膜病 )、 无症状性脑梗死、 全身炎症反应综合征 (SIRS)、 移植肾肾小球病、 葡萄膜炎、 血管泄露综合征、 玻璃体出血以及 Von Hipple Lindau 病。此外， 已知一些药物 ( 包括那些用于治疗多发性硬化的药物 ) 会引起血管通透性过高， 并且达那唑可以用来减少在使用这些药物时的上述不期望的副作用。 遗传性和获得性血管 性水肿可以明确地与那些可以通过本发明治疗的疾病和病症区分。
在本文中使用的 “治疗” 表示减少 ( 全部或部分地 ) 症状、 减少疾病或病症的持续 时间或严重程度， 包括治愈疾病， 或预防疾病或病症。
近期的证据显示转胞吞作用 - 引起的通透性过高是在多种疾病和病症中最终导 致组织和器官损害的过程的第一步。因此， 本发明提供在这些疾病和病症中的早期介入手 段， 其能够减少、 延迟或甚至潜在地预防在这些疾病和病症中组合和器官的损伤。例如， 基 于对于能够通过本发明治疗的疾病或病症 ( 上述的那些疾病和病症 ) 中的一种的诊断， 可 以对动物立即进行治疗。 备选地， 优选对于下述动物的治疗， 所述动物在存在症状之前具有 发展为这样的疾病或症状的表现或倾向。糖尿病、 高血压以及动脉粥样硬化的早期表现以 及危险度因子是众所周知的， 并且对于显示这些早期表现或危险度因子的动物的治疗可以 在疾病或病症的症状存在之前开始 ( 即预防地 )。
例如， 根据诊断， 对于被确诊为患有糖尿病的患者的治疗可以立即开始。具体地， 糖尿病患者应当优选在出现血管并发症的任何症状之前， 用达那唑化合物来治疗， 尽管这 经常是不可能的， 因此大多数糖尿病患者在其确诊时已显示这些症状 ( 参见下文 )。备选 的， 糖尿病患者应当在非增生性糖尿病性视网膜病较为轻微 ( 即， 小动脉瘤和视网膜内出 血的轻微水平 ) 时接受治疗。参见 Diabetic Retinopathy， 第 9 页 ( 编辑 Elia Duh， M.D.， Human Press， 2008)。这样的早期治疗可以提供预防黄斑水肿和从视网膜病变发展为增生 性糖尿病性视网膜病的最佳机会。此外， 糖尿病性视网膜病的存在被认为是其它糖尿病的 微血管并发症存在或将会发展的表现 ( 参见 Id.， 474-477 页 )， 并且早期的治疗还可以预防 或减少这些其它的并发症。当然， 糖尿病血管并发症的更为发展的疾病和病症也可以利用 有益结果来治疗。
但是， 如上文所述， 在糖尿病被确诊时， 血管并发症通常已经存在。 相应地， 优选对 于具有发展为糖尿病的早期表现或倾向的病人进行预防性治疗。 这些早期表现和危险度因 子包括空腹血糖高但是还未足够确定为糖尿病 ( “糖尿病前期” )、 高胰岛素血症、 高血压、 血 脂障碍 ( 高胆固醇、 高甘油三酯、 高低密度脂蛋白、 和 / 或低水平高密度脂蛋白 )、 肥胖 ( 体 重指数高于 25)、 不活泼、 超过 45 岁、 睡眠不足、 家族糖尿病史、 少数种族、 妊娠糖尿病史、 以 及多囊卵巢综合征史。
相似地， 根据诊断， 对于被确诊为患有高血压的患者的治疗可以立即开始。 高血压 通常不会引起任何症状， 但是对于具有发展为高血压的倾向的患者可以开始预防性治疗。 高血压的危险度因子包括年龄、 种族 ( 在黑人中高血压更为常见 )、 家族史 ( 高血压在家族 中延续 )、 超重或肥胖、 缺乏活力、 吸烟、 饮食中盐分过多、 饮食中钾过少、 饮食中维生素 D 过 少、 饮酒过多、 压力水平高、 一定的慢性条件 ( 例如， 高胆固醇、 糖尿病、 肾脏疾病以及睡眠性呼吸暂停 ) 以及使用某些药物 ( 例如， 口服避孕药、 、 减肥药丸、 以及其它冷和过敏 药物 (allergy medications))。
对于被确诊为动脉粥样硬化的患者可以在诊断后立即开始治疗。但是， 优选对于 具有发展为动脉粥样硬化的早期表现或倾向的患者进行预防性治疗。 动脉粥样硬化的早期 表现和危险度因子包括年龄、 动脉瘤或早期心脏疾病的家族史、 高血压、 高胆固醇、 高甘油 三酯、 胰岛素耐受性、 肥胖、 吸烟、 缺乏体力活动、 不健康饮食、 以及高 C- 反应蛋白水平。
用来抑制血管通透性过高的本发明的方法包括向有此需要的动物给药有效量的 达那唑化合物以抑制血管通透性过高。在此使用的 “达那唑化合物” 是指达那唑、 达那唑的 前药以及达那唑和其前药药学上可接受的盐。
“前药” 表示当向动物给药这类前药时， 在体内释放活性母体药物 ( 在本案中为达 那唑 ) 的任何化合物。达那唑的前药包括如下 ： 达那唑中的羟基与任何基团键合并且可以 在体内被切断从而产生自由的羟基的物质。达那唑前药的实例包括达那唑的酯 ( 例如， 乙 酸酯、 甲酸酯、 以及苯甲酸酯衍生物 )。
达那唑和其前药药学上可接受的盐包括传统的非毒性盐、 例如来自于无机酸 ( 例 如， 盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 磷酸、 硝酸等 ) 的盐、 来自于有机酸 ( 例如， 乙酸、 丙酸、 琥珀酸、 乙醇 酸、 硬脂酸、 乳酸、 苹果酸、 酒石酸、 柠檬酸、 谷氨酸、 天冬氨酸、 苯甲酸、 水杨酸、 草酸、 抗坏血 酸等 ) 的盐、 或来自于碱 ( 例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、 碳酸盐、 碳酸氢盐 或来自于 N， N- 二苄基乙二胺、 D- 葡糖胺、 或乙二胺的有机阳离子 ) 的盐。这些盐可以通过 常规方式制备， 例如用酸来中和化合物的游离碱形式。 具体地， 异噁唑例如达那唑是弱碱性 物质并且在加入强酸的条件下会形成酸加成盐， 以及在加入强酸的酯 ( 例如， 强无机或有 机磺酸的酯， 优选低级烷基、 低级烯基或低级芳烷基酯， 例如甲基碘、 乙基碘、 乙基溴、 丙基 溴、 丁基溴、 烯丙基溴、 硫酸甲酯、 苯磺酸甲酯、 对甲苯磺酸甲酯、 苄基氯等 ) 的条件下会形 成季铵盐。参见美国专利 No.3,135,743。
如上所述， 达那唑化合物可以用来抑制血管通透性过高以及治疗由血管通透性过
高引起的疾病或病症。为了实现上述， 向需要此治疗的动物给药达那唑化合物。优选地， 所 述动物为哺乳动物， 例如兔子、 山羊、 狗、 猫、 马或人。最优选所述动物为人。
本发明化合物 ( 即达那唑、 达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受 的盐 ) 的有效地用药形式、 给药方式以及用药量可以利用在此给出的指导根据经验来确 定。 本领域技术人员理解的是针对待治疗的具体的疾病或病症、 疾病或病症的严重程度、 给 药途径 ( 一个或多个 )、 治疗的持续时间、 对动物给药任何其它药物的鉴别、 动物的年龄、 大 小以及物种、 以及在医学和兽医学领域已知的类似因素， 用药量会发生变化。通常来说， 本 发明化合物的合适的每天的剂量是对于产生治疗效果有效的最低剂量的化合物量。但是， 每天的用药将在足够医学判断的范围内由参加的医师或兽医来确定。如果需要， 有效的每 天的剂量可以分成两次、 三次、 四次、 五次、 六次或更多次分次给药 (sub-dose) 来给药， 在 每天合适的时间间隔单独给药。该化合物的给药应当持续直到取得可接受的反应。
之 前 已 经 有 报 道 称 达 那 唑 化 合 物 可 以 抑 制 血 管 发 生。 参 见 PCT 申 请 WO2007/009087。令人吃惊以及相当意外的是， 已经发现可以用来在最佳剂量实现本发 明的达那唑化合物低于之前报道的用于抑制血管发生的达那唑化合物约 100-1000 倍， 并且显著低于目前对患者给药以治疗其它疾病和病症的那些量 ( 通常地， 对于成年人为 200-800mg/ 天 )。使用这些较低剂量的达那唑化合物会避免任何显著的副作用， 可能会避 免所有的副作用， 这对于根据本发明的疾病以及病症的早期或预防性治疗是非常有利的。 具体来说， 抑制血管通透性过高的达那唑化合物的有效剂量可以为 0.1ng/kg/ 天～ 35mg/kg/ 天， 优选为 40ng/kg/ 天～ 5.0mg/kg/ 天， 最优选 100ng/kg/ 天～ 1.5mg/kg/ 天。有效的剂量也可以是如下剂量 ： 可以在相关液体 ( 例如血液 ) 中产生 0.0001μM ～ 5μM， 优选 0.1μM ～ 1.0μM， 更优选 0.1μM ～ 0.5μM， 最优选约 0.1μM 的浓度。有效剂 量也可以是如下剂量 ： 可以在待治疗的组织或器官中产生约 0.17％ ( 重量 / 重量 ) 或更少， 优选 0.00034％～ 0.17％， 最优选 0.0034％～ 0.017％的浓度。当局部地或部分地给药时， 优选以 0.0001μM ～ 5μM， 优选以 0.1μM ～ 1.0μM， 更优选以 0.1μM ～ 0.5μM， 最优选 以约 0.1μM 的浓度给药达那唑化合物， 或优选以约 0.17％ ( 重量 / 重量 ) 或更少， 优选以 0.00034％～ 0.17％， 最优选以 0.0034％～ 0.017％的浓度给药达那唑化合物。 当口服给药 成年人时， 优选剂量为约 1ng/ 天～约 100mg/ 天， 更优选剂量为约 1mg/ 天～约 100mg/ 天， 最优选剂量为约 10mg/ 天～约 90mg/ 天， 优选以每天两次相同的剂量给药。此外， 由于期待 达那唑在细胞和组织中积累， 因此在一段时间之后 ( 例如， 2-4 周 ) 可以将初始 ( 上样 ) 剂 量 ( 例如， 每天 100mg) 降低至更低的保持剂量 ( 例如， 每天 1mg)， 这可能会导致不确定的副 作用而不是显著的副作用， 也可能将会没有任何副作用。定义在本文中使用的达那唑化合 物的 “血管 - 通透性过高 - 抑制剂量” 是指上述在本段落中描述的那些量。
本发明还提供调节动物中内皮细胞细胞骨架的方法。 本发明的该实施方式是基于 如下发现 ： 达那唑抑制 F- 肌动蛋白张力丝的形成、 引起皮质肌动蛋白环 (cortical actin ring) 的形成、 通过磷酸鞘氨醇 (S1P) 促进以及延长皮质肌动蛋白环的形成、 抑制 RhoA、 增 加 VE- 钙粘蛋白的磷酸化、 可能会激活屏障 - 稳定化 GTPase 以及可能会稳定微管。细胞 骨架的调节可以降低血管通透性过高以及提高血管通透性过低 ( 例如， 通透性低于基础水 平 )， 由此使内皮重新为内环境稳定。相应地， 由血管通透性过高引起的这些疾病和病症可 以被治疗 ( 参见上文 ) 并且由血管通透性过低引起的那些疾病和病症也可以被治疗。后一
类型的疾病和病症包括肝脏老化、 动脉粥样硬化生成、 动脉粥样硬化、 肝硬化、 肝脏纤维化、 肝功能衰竭、 以及原发性肝癌和转移性肝癌。
调节内皮细胞细胞骨架的方法包括向动物给药有效量的达那唑化合物。 “达那唑 化合物” 和 “动物” 具有与上述相同的含义。
用于调节细胞骨架的本发明化合物 ( 即达那唑、 达那唑的前药或者它们中的任何 一种的药学上可接受的盐 ) 的有效地用药形式、 给药方式以及用药量可以利用在此给出的 指导根据经验来确定。本领域技术人员理解的是针对待治疗的具体的疾病或病症、 疾病或 病症的严重程度、 给药途径 ( 一个或多个 )、 治疗的持续时间、 对动物给药任何其它药物的 鉴别、 动物的年龄、 大小以及物种、 以及在医学和兽医学领域已知的类似因素， 用药量会发 生变化。通常来说， 本发明化合物的合适的每天的剂量是对于产生治疗效果有效的最低剂 量的化合物量。但是， 每天的用药将在足够医学判断的范围内由参加的医师或兽医来确 定。如果需要， 有效的每天的剂量可以分成两次、 三次、 四次、 五次、 六次或更多次分次给药 (sub-dose) 来给药， 在每天合适的时间间隔单独给药。该化合物的给药应当持续直到取得 可接受的反应。
具体来说， 用于调节内皮细胞细胞骨架的达那唑化合物的有效剂量可以为 0.1ng/ kg/ 天～ 35mg/kg/ 天， 优选为 40ng/kg/ 天～ 5.0mg/kg/ 天， 最优选 100ng/kg/ 天～ 1.5mg/ kg/ 天。 有效的剂量也可以是如下剂量 ： 可以在相关液体 ( 例如血液 ) 中产生 0.0001μM ～ 5μM， 优选 0.1μM ～ 1.0μM， 更优选 0.1μM ～ 0.5μM， 最优选约 0.1μM 的浓度。有效剂 量也可以是如下剂量 ： 可以在待治疗的组织或器官中产生约 0.17％ ( 重量 / 重量 ) 或更少， 优选 0.00034％～ 0.17％， 最优选 0.0034％～ 0.017％的浓度。当局部地或部分地给药时， 优选以 0.0001μM ～ 5μM， 优选以 0.1μM ～ 1.0μM， 更优选以 0.1μM ～ 0.5μM， 最优选 以约 0.1μM 的浓度给药达那唑化合物， 或优选以约 0.17％ ( 重量 / 重量 ) 或更少， 优选以 0.00034％～ 0.17％， 最优选以 0.0034％～ 0.017％的浓度给药达那唑化合物。 当口服给药 成年人时， 优选剂量为约 1ng/ 天～约 100mg/ 天， 更优选剂量为约 1mg/ 天～约 100mg/ 天， 最优选剂量为约 10mg/ 天～约 90mg/ 天， 优选以每天两次相同的剂量给药。此外， 由于期待 达那唑在细胞和组织中积累， 因此在一段时间之后 ( 例如， 2-4 周 ) 可以将初始 ( 上样 ) 剂 量 ( 例如， 每天 100mg) 降低至更低的保持剂量 ( 例如， 每天 1mg)， 这可能会导致不确定的副 作用而不是显著的副作用， 也可能将会没有任何副作用。
本发明化合物 ( 即达那唑、 达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受 的盐 ) 可以通过任何合适的给药途径给药治疗的动物患者， 所述给药途径包括口服、 经鼻、 非经肠道 ( 例如， 静脉、 腹膜内、 皮下或肌内 ) 途径。根据本发明可以治疗的任何疾病或病 症通常优选口服给药。用来治疗眼部的疾病和病症的优选的给药方式为口服、 眼内和局部 给药。最优选的为口服。相当意外以及令人惊奇的是， 眼部的疾病可以通过口服达那唑化 合物来治疗， 这是因为之前还没有报道称通过口服药物成功地治疗这类疾病和病症。治疗 脑的疾病和病症优选的给药方式是口服和非经肠道给药。优选口服给药。
尽管可以单独给药本发明的化合物， 但优选作为药物制剂 ( 组合物 ) 给药。本 发明的药物组合物包括本发明的化合物 ( 一个或多个 ) 作为活性成分， 其与一种或多种 药学上可接受的载体混合， 以及任选与一种或多种其它化合物、 药物和其它材料混合。每 种载体在与制剂的其它成分的相容性方面必须是 “可以接受的”并且对于动物是无害的。在本领域中药学上可接受的载体是已知的。与所选择的给药途径无关， 可以通过本领 域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物配制成药学上可接受的剂型。参见例如， Remington’ sPharmaceutical Sciences。
适合口服给药的本发明的制剂可以是如下形式 ： 胶囊、 扁囊剂、 药丸、 片剂、 粉末、 颗粒或作为含水或不含水液体中的溶液或悬浮液、 或水包油或油包水液体乳剂， 或酏剂、 糖 浆、 锭剂 ( 使用不活性基底， 例如明胶和甘油， 或蔗糖以及阿拉伯胶 ) 等， 每种均含有特定量 的本发明的化合物 ( 一种或多种 ) 作为活性成分。本发明的化合物 ( 一种或多种 ) 还可以 以推注、 药糖剂以及糊状形式给药。
在用于口服给药的本发明固体制剂形式 ( 胶囊、 片剂、 药丸、 糖衣丸、 粉末、 颗粒 等 ) 中， 活性成分 ( 即达那唑、 达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐， 或上述物质的组合物 ) 与一种或多种药学上可接受的载体混合， 例如柠檬酸钠或磷酸氢钙 和 / 或下述中的任何 ： (1) 填料或膨胀剂， 例如淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露糖和 / 或硅 酸； (2) 粘合剂例如， 羧甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 蔗糖和 / 或阿拉伯胶 ； (3) 保湿剂例如甘油 ； (4) 崩解剂， 例如琼脂、 碳酸钙、 马铃薯或木薯淀粉、 藻酸、 特定的硅酸 盐、 以及碳酸钠 ； (5) 阻溶液剂 (solution retarding agent)， 例如石蜡 ； (6) 吸收促进剂， 例如季铵化合物 ； (7) 润湿剂， 例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯 ； (8) 吸收剂， 例如高岭土和膨 润土 ； (9) 润滑剂， 例如滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠、 以及它 们的混合物 ； 以及 (10) 着色剂。 在为胶囊、 片剂和药丸的情况下， 药物组合物还可以含有缓 冲剂。 相似类型的固体组合物可以以如下形式利用 ： 作为在利用赋形剂例如乳糖、 和高分子 量聚乙二醇等的、 在软和硬 - 填充的明胶胶囊中的填料。
片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分压缩或模塑来制备。 压缩片剂可以通过 使用粘合剂 ( 例如， 明胶或或羟丙基甲基纤维素 )、 润滑剂、 惰性稀释剂、 防腐剂、 表面活性 剂 ( 例如， 羧甲淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠 )、 表面活性或分散剂来制备。模制片剂可 以通过在适当的机械中模塑通过惰性液体稀释剂润湿的成粉末状的化合物来制备。
片剂， 以及本发明药物组合物的其它固体剂型， 例如糖衣丸、 胶囊、 药丸和颗粒剂 可以任选利用涂层或壳 ( 例如肠溶性涂层和在药剂学领域中已知的其它涂层 ) 来获得或制 备。也可以使用如下物质来制备从而可以提供其中的活性成分的缓慢或受控释放， 所述物 质例如， 变化比例的羟丙基甲基纤维素从而提供所期望的释放曲线， 其它聚合物基体， 脂质 体和 / 或微球。可以利用例如通过细菌滤器 (bacteria-retaining filter) 来过滤以对其 进行灭菌。 这些组合物还可以任选含有遮光剂， 以及可以为如下的组合物， 该组合物可以在 胃肠道的特定部位仅释放或优选释放活性成分， 任选地以延迟的方式释放。可以使用的包 埋组合物的实例包括多聚物质和蜡。活性成分也可以为微囊化形式。
用于本发明化合物的口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、 微乳剂、 溶 液、 悬浮液、 糖浆以及酏剂。除了活性成分之外， 液体剂型可以含有通常用于本领域的惰性 稀释剂， 例如水或其它溶剂， 增溶剂和乳化剂， 例如乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 苯甲 醇、 苯甲酸苄酯、 丙二醇、 1， 3- 丁二醇、 油 ( 尤其是棉花子油、 花生油、 玉米油、 胚油、 橄榄油、 蓖麻油以及芝麻油 )、 甘油、 四氢呋喃甲醇、 聚乙二醇以及山梨糖醇酐的脂肪酸酯、 以及它们 的混合物。
除了惰性稀释剂， 口服组合物还可以包括例如润湿剂、 乳化和悬浮剂、 甜化剂、 调味剂、 着色剂、 芳香剂以及防腐剂。
除了活性成分之外， 悬浮液还可以含有悬浮剂例如， 乙氧基化异十八烷醇、 聚氧乙 烯山梨糖醇和山梨糖醇酐酯、 微晶纤维素、 氢氧化铝氧化物、 膨润土、 琼脂以及黄蓍树胶， 以 及它们的混合物。
本发明还提供适合用于眼部治疗的药物产品。这样的药物产品包括药物组合物、 装置和植入物 ( 其可以是组合物或装置 )。
用于向眼球中眼内注射本发明的化合物 ( 一种或多种 ) 的药物制剂 ( 组合 物 ) 包括 ： 溶液、 乳剂、 悬浮液、 颗粒、 胶囊、 微球、 脂质体、 基体等。参见， 例如， 美国专利 No.6,060,463， 美国专利申请公开 No.2005/0101582 和 PCT 申请 WO 2004/043480， 在此将 它们完整的公开内容引入作为参考。例如， 用于眼内注射的药物制剂可以包括一种或多种 本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗的含水或不含水溶液、 悬浮液或乳 剂， 其可以含有抗氧化剂、 缓冲液、 悬浮剂、 增稠剂或增粘剂 ( 例如透明质酸聚合物 )。合适 的含水和不含水载体的实例包括 ： 水、 盐水 ( 优选 0.9％ )、 含葡聚糖的水 ( 优选 5％ )、 缓 冲液、 二甲基亚砜、 醇类和多元醇 ( 例如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 )。这些组合物还可以包 含辅助剂， 例如润湿剂和乳化剂， 以及分散剂。此外， 可注射药物型的延长吸收可以通过包 含在延迟吸收的试剂中来实现， 所述试剂例如聚合物和明胶。可注射积存型 (injectable depot form) 可以通过将药物结合到微胶囊或微球中来制备， 所述微胶囊或微球由生物 可降解聚合物例如聚乳酸 - 聚羟基乙酸制备。其它生物可降解聚合物的实例包括聚原 酸酯、 聚乙醇酸、 聚乳酸、 聚己内酯和聚酸酐 (poly(anhydrides))。积存注射制剂 (depot injectable formulation) 也可以通过使药物陷入到与眼部组织相容的脂质体 ( 由常用组 分形成， 例如二棕榈酰磷脂酰胆碱 ) 或微乳剂中来制备。根据药物和聚合物或脂质的比例， 具体的聚合物或脂质成分的性质， 所使用的脂质体的类型， 以及微胶囊或微球被是否被包 覆， 可以控制药物从微胶囊、 微球和脂质体中释放的速率。
本发明化合物也可以通过外科手术作为眼部植入物的形式给药。例如， 可以将 具有聚乙烯醇或聚乙酸乙烯酯扩散壁以及含有本发明化合物 ( 一种或多种 ) 储存容器 (reservoir container) 移植到巩膜中或移植到巩膜上。 另外的例子， 可以将本发明的化合 物 ( 一种或多种 ) 结合到由聚合物制备的聚合物基体中， 所述聚合物例如聚己内酯、 聚乙醇 酸、 聚乳酸、 聚酸酐或脂质 ( 例如癸二酸 )， 并将其移植到巩膜上或眼部内。 上述方法通常通 过下述过程来完成 ： 针对接受局部或部分麻醉的动物并且利用在角膜后的小切口。 然后， 通 过切口插入该基体并且与巩膜缝合。
本发明的化合物还可以局部给药到眼部， 本发明优选的实施方式为适用于眼部的 局部的药物组合物。适用于眼部的局部的药物组合物包括溶液、 悬浮液、 分散液、 滴剂、 凝 胶、 水凝胶以及软膏剂。参见， 例如美国专利 No.5,407,926 和 PCT 申请 WO 2004/058289、 WO 01/30337 和 WO 01/68053， 在此将它们完整的公开内容引入作为参考。
适用于眼部的局部的制剂包括在含水或不含水基底中的一种或多种本发明的化 合物。局部的制剂还可以包括吸收促进剂、 渗透促进剂、 增稠剂、 粘度提高剂、 用于调节和 / 或保持 pH 的试剂、 用于调节渗透压的试剂、 防腐剂、 表面活性剂、 缓冲液、 盐 ( 优选氯化钠 )、 助悬剂、 分散剂、 增溶剂、 稳定剂和 / 或张度剂。适用于眼部的局部的制剂优选包括吸收或 渗透促进剂以促进本发明化合物 ( 一种或多种的 ) 吸收或渗透到眼部中， 和 / 或包括可以提高本发明的化合物 ( 一种或多种 ) 在眼部的停留时间的增稠剂或粘度提高剂。参见 PCT 申请 WO 2004/058289、 WO 01/30337 和 WO 01/68053。吸收 / 渗透促进剂的例子包括单独 的二甲基砜或与二甲基亚砜结合的二甲基砜、 羧酸和表面活性剂。增稠剂和粘度提高剂的 例子包括葡聚糖、 聚乙二醇、 聚乙烯吡咯烷酮、 多糖凝胶、 纤维素类聚合物 ( 例如 羟丙基甲基纤维素 )、 含羧基的聚合物 ( 例如丙烯酸的聚合物或共聚物 )、 聚乙烯醇和透明 质酸或其盐。
适合用于眼部治疗的液体剂型 ( 例如， 溶液、 悬浮液、 分散液以及滴剂 ) 可以通过 例如如下方法来制备 ： 将本发明的化合物 ( 一种或多种 ) 溶解、 分散、 悬浮等在载体中， 所述 载体例如水、 盐水、 含水葡聚糖、 甘油、 乙醇等， 从而形成溶液、 分散液或悬浮液。如果需要， 该药物制剂还可以含有微量无毒性的辅助物质， 例如润湿或乳化剂、 pH 缓冲剂等， 例如， 乙 酸钠、 脱水山梨醇单月桂酸酯、 三乙醇胺乙酸钠 (triethanolamine sodium acetate)、 三乙 醇胺油酸酯等。
适合用于眼部治疗的含水的溶液和悬浮液除了本发明的化合物 ( 一种或多种 ) 之 外， 可以包括防腐剂、 表面活性剂、 缓冲液、 盐 ( 优选氯化钠 )、 张度剂以及水。 如果使用悬浮 液， 颗粒大小应当小于 10μm 以最小化对眼部的刺激。如果使用溶液或悬浮液， 传递到眼部 的量应当不超过 50μl 以防止过量的溶液或悬浮液从眼部漏出。 适合用于眼部治疗的胶体悬浮液通常通过微粒 ( 即， 微球、 纳米球、 微胶囊或纳米 胶囊， 其中微球和纳米球通常为其中陷入有、 吸附有或以其它方式含有制剂的聚合物的整 体颗粒， 而针对微胶囊和纳米胶囊， 制剂通常装入在胶囊中 ) 来形成。这些微粒的大小的上 限为约 5μ ～约 10μ。
适合用于眼部治疗的眼部的软膏剂包括在合适的基底中的本发明的化合物 ( 一 种或多种 )， 所述基底例如矿物油、 液态羊毛脂、 白凡士林、 上述物质的两种或全部三种的混 合物， 或聚乙烯 - 矿物油凝胶 (polyethylene-mineral oil gel)。可以任选包括防腐剂。
适合用于眼部治疗的眼部的凝胶包括悬浮在亲水基底中的本发明化合物 ( 一 种或多种 )， 所述亲水基底例如 Carpobol-940 或乙醇、 水和丙二醇的混合物 ( 例如， 以 40 ∶ 40 ∶ 20 的比例 )。使用了胶凝剂， 例如羟乙基纤维素、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤 维素或甘草酸铵 (ammoniated glycyrrhizinate)。可以任选包括防腐剂和 / 或张度剂。
适合用于眼部治疗的水凝胶通过与可膨胀的、 形成凝胶的聚合物混合来形成， 所 述聚合物例如上述列出的作为增稠剂或粘度提高剂的那些， 除了在本领域中被称作 “水凝 胶” 的通常与被称作 “增稠的” 溶液或悬浮液的制剂相比具有更高粘度的那些制剂之外。与 上述预先制成的水凝胶不同， 也可以制备制剂， 使得在将其给药到眼部后原位地形成水凝 胶。这样的凝胶在室温下为液体但是在更高的温度下为凝胶状 ( 因此将其称为 “热可逆” 水凝胶 )， 所述更高的温度例如当放置使其与体液接触时。提供上述性质的可生物相容的 聚合物包括丙烯酸聚合物和共聚物、 N- 异丙基丙烯酰胺衍生物和环氧乙烷和环氧丙烷的 ABA 嵌段共聚物 ( 通常被称作 “泊洛沙姆 (poloxamer)” ， 并且以 商品名可以从 BASF-Wayndotte 商购 )。
优选的分散液为脂质体型， 在这种情况下， 制剂被包围在脂质体 ( 由交替的含水 隔室 (compartment) 和脂质双分子层构成的微囊泡 ) 中。
可以利用含水或不含水的基备眼部滴剂还含有一种多种分散剂、 增溶剂或助
悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于滴加地传递液体成分 ( 借助 于特殊形状的闭合物 ) 的塑料瓶来传递滴剂。
还可以借助插入到眼部的浸渍有药物的固体载体来局部地施加本发明的化合物。 通常通过聚合物的溶出或生物侵蚀， 渗透或它们的组合来影响药物的释放。可以使用一些 基体型传输 (matrix-type delivery) 系统。这样的系统包括用所期望的本发明的化合物 浸渍或浸泡的亲水的软性隐形眼镜， 以及在放入到眼部后不需要将其拿出的其它生物可降 解或可溶的部件。 这些可溶的眼部植入物可以由眼部能够忍受的并且与待给药的本发明化 合物相容的任何可降解物质形成。这样的物质包括但不限于 ： 聚乙烯醇、 聚丙烯酰胺、 丙烯 酸乙酯以及乙烯基吡咯烷酮的聚合物和共聚物， 以及交联的多肽或多糖 ( 例如甲壳质 )。
用于其它类型局部给药 ( 即， 不是针对眼部 ) 或用于经皮肤给药本发明化合物的 剂型包括粉末、 喷雾、 软膏剂、 糊剂、 乳膏、 洗剂、 凝胶、 溶液、 贴片 (patch)、 滴剂以及吸入剂。 可以在无菌条件下， 将活性成分与药学上可接受的载体， 与任何缓冲剂， 或者根据需要与抛 射剂 (propellant) 混合。软膏剂、 糊剂、 乳膏和凝胶除了含有活性成分之外， 可以含有赋形 剂， 例如动物和植物脂肪、 油、 蜡、 石蜡、 淀粉、 黄芪胶、 纤维素衍生物、 聚乙二醇、 硅树脂、 膨 润土、 硅酸、 滑石、 氧化锌或它们的混合物。 粉末和喷雾除了含有活性成分之外， 可以含有赋 形剂例如乳糖、 滑石、 硅酸、 氢氧化铝、 硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。 喷雾还 任选含有常用的抛射剂例如氯氟烃以及可挥发的未取代烃 ( 例如丁烷和丙烷 )。经皮贴片 具有附加的优点， 即提供本发明化合物到身体的可控传递。这样的剂型可以通过将本发明 的一种或多种化合物溶解、 分散或以其它方式结合到合适的介质中来制备， 所述介质例如 弹性体基体材料。吸收促进剂也可以用于增加化合物跨皮肤的流动。这样的流动的速率可 以通过提供速度可控膜或将化合物分散到聚合物基体或凝胶中来控制。 浸渍有药物的固体 载体 ( 例如， 包扎 (dressing)) 也可以用于局部给药。
药物制剂包括合适用于通过吸入或鼻吸入法或用于鼻部给药的那些药物制 剂。对于通过吸入法给药到上 ( 鼻部 ) 或下呼吸道， 通常通过吸入器、 喷雾器或加压包 (pressurized pack) 或传递喷雾剂的其它方便装置来传递本发明的化合物。 加压包可以包 括合适的抛射剂， 例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷、 二氧化碳或其它合适的 气体。在加压气雾剂的情况下， 剂量单位可以通过提供用来传递已测定的量的阀来确定。
备选地， 对于通过吸入法或鼻吸入法给药， 组合物可以采取干燥粉末的形式， 例如 一种或多种本发明化合物， 以及合适的粉末基底的粉末混合物， 所述粉末基底例如乳糖或 淀粉。粉末组合物可以以在例如胶囊或药筒， 或者在例如明胶或泡罩包装 (blister pack) 中的单位剂量形式呈现， 在气雾吸入器、 吸入器或测定剂量的吸入器的帮助下可以从上述 单元中给药粉末。
对于鼻内给药， 可以借助于鼻滴剂或液体喷雾的形式给药本发明化合物， 例如借 助于塑料瓶喷雾器或测定剂量的吸入器。液体喷雾通常由加压包传递。喷雾器的典型例子 为 Mistometer(Wintrop) 和 Medihaler(Riker)。
可以利用含水或不含水的基备的鼻滴剂还含有一种或多种分散剂、 增溶剂或 助悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于滴加地传递液体成分 ( 借 助于特殊形状的闭合物 ) 的塑料瓶来传递滴剂。
适合用于非消化道给药的本发明药物组合物包括一种或多种本发明的化合物和一种和多种药学上可接受的无菌的等渗含水或不含水溶液、 分散液或乳剂、 或可以在即将 使用前重新形成无菌可注射溶液或分散液的粉末， 其可以含有抗氧化剂、 缓冲液、 将制剂与 待受试者血液等渗的溶质， 或助悬剂或增稠剂。此外， 可以使用药物包覆的支架 (stent)。
可以用于本发明药物组合物的合适的含水和不含水的载体的例子包括水、 乙醇、 多元醇 ( 例如， 甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等 )、 以及它们的适当的混合物、 植物油 ( 例如橄榄 油 )、 以及可注射的有机酯 ( 例如油酸乙酯 )。通过使用包覆材料 ( 例如卵磷脂 )， 在分散液 的情况下通过保持所需的颗粒大小， 以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。
这些组合物还可以含有辅助剂， 例如润湿剂、 乳化剂和分散剂。 在组合物中还期望 包含等渗试剂， 例如糖、 氯化钠等。此外， 可注射药物型的延长吸收可以通过包含在延迟吸 收的试剂中来实现， 所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。
在一些情况中， 为了延长药物的效果， 期望可以放慢从皮下或肌内注射中吸收药 物。这可以通过使用晶体或具有较差水溶液性的无定形材料的液体悬浮液来实现。药物吸 收的速率取决于其溶解的速率， 其溶解的速率可能取决于晶体的大小和晶型。 备选地， 非消 化道给药药物的延迟吸收可以通过在油媒介物中溶解或悬浮该药物来实现。
可注射积存形式可以通过在可生物降解的聚合物 ( 例如聚乳酸 - 聚羟基乙酸 ) 中 形成所述药物的微胶囊型基体来制备。根据药物和聚合物的比例， 使用的具体的聚合物的 性质， 可以控制药物释放的速率。 其它可生物降解的聚合物的实例包括聚原酸酯和聚酸酐。 积存注射制剂也可以通过使药物陷入到与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。 可以 对注射材料进行灭菌， 例如利用细菌滤器来过滤。
可以将制剂放置在单位剂量或多剂量经密封的容器中， 例如安瓿和药水瓶， 以及 可以在冻干的条件下保存并且仅需要在即将使用前， 添加灭菌的液体载体， 例如用于注射 的水。临时的注射溶液以及悬浮液可以通过上述无菌粉末、 颗粒剂和片剂类型来制备。
可以单独提供达那唑化合物以治疗涉及血管通透性过高或细胞骨架的功能障碍 的疾病或病症。备选的， 达那唑化合物可以与一种或多种其它适合用于治疗上述疾病或病 症的治疗或药物结合提供。例如， 可以在其它治疗或药物之前， 结合其它治疗或药物 ( 包 括同时 )， 或者在其它治疗或药物之后给药该达那唑化合物。在使用另外药物的情况下， 该 药物和达那唑化合物可以以单独的药物组合物的形式给药或作为相同的药物组合物的部 分给药。合适的药物例如描述在美国申请 12/820,325 号中， 将其全部内容在此引用作为参 考。
通过考虑下述非限制性实施例， 本发明另外的主题、 优点和新特征对于本领域技 术人员米乐M6官网登录入口来说是显然的。 实施例 实施例 1 ： 达那唑对于血管发生的影响 ( 比较的 )
37℃和 5％ CO2 中。当由供给人指出 60-80％会合时， 利用胰蛋白酶进行次代培养。
作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的差异利用标准 t- 检测在 Microsoft Excel 软件中进行分析。P ＜ 0.05 被认为是统计学上的显著。
在 一 段 时 间， 在 达 那 唑 存 在 时 培 养 的 初 始 的 HUVEC 减 少 了 利 用 Promega celltiter 增殖分析获得的 OD， 并且具有剂量依赖趋势 ( 图 1)。Celltiter 分析基于由于 脱氢酶引起的分析溶液形成的甲月替染料的减少， 其直接与细胞数量关联。
在 24 小时时， 只有在非常高的剂量下， 达那唑处理似乎是有效的。在 10μM 或更 高浓度的达那唑时观察到 OD 分析中的显著的降低 (p 值＜ 0.05)。在无达那唑的孔中检 测到的 OD 为 0.414±0.06， 以及利用 10μM 达那唑处理使 OD 降低至 0.288+0.037， 而利用 100μM 达那唑处理使得 OD 降低至 0.162+0.017， 分别相当于 30％和 65％的抑制率。
在 48 小时时， 甚至在 1μM 的水平时也可以观察到显著地抑制。48 小时后在培养 物中得到的无达那唑的读数增加至 0.629±0.095， 以及利用 1μM 时降低至 0.378±0.037， 利用 10μM 时降低至 0.241±0.012， 以及利用 100μM 时降低至 0.19±0.033( 或抑制率分 别为 40％、 61％和 70％ )。
在所有时间点， 全部 100μM 达那唑剂量得到的检测结果是一致的， 显示在该浓度 可以完全阻止细胞增殖。
为了说明达那唑能否阻止由 HUVEC 形成管样结构， 使用了含有基质胶的 96 孔 板。在生成血管的物质的存在下， 并且提供了细胞外基质结构 (extracellular matrix scaffold) 培养内皮细胞， 内皮细胞会分化成结构松散的类毛细血管。 在达那唑存在下生长 的 HUVEC 与对照相比， 显示为具有较细和较少确定的关联的更为不组织化的结构 ( 参见图 2， 其中 A ＝对照， B ＝ 1μM 达那唑， C ＝ 10μM 达那唑， D ＝ 50μM 达那唑， 以及 E ＝ 50μM LY294002)。利用 50μM 达那唑处理导致位于基质胶上的分离的 HUVEC 群落， 其具有非常少 的、 细的联系或血管内腔空间。达那唑的影响与阳性对照化合物 LY294002 非常相似。为了 确定所使用的媒介没有影响， 利用相当于所使用的最高剂量的达那唑的乙醇处理孔， 并且 观察到对于管形成没有影响 ( 数据未示出 )。这些数据显示在 50μM， 达那唑是管形成的有 效抑制剂。在 1μM 或 10μM， 达那唑对于管形成没有影响。
图 3 示出的结果。作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的 差异利用标准 t- 检测在 Microsoft Excel 软件中进行分析。P ＜ 0.05 被认为是统计学上 的显著。
使用多孔的、 基质胶包覆的植入物确定达那唑是否可以影响内皮细胞的侵入或迁 移 ( 图 3)。 在用于本研究的系统中， 在将 FCS 加入到与内皮细胞相反的室内之后， 通过荧光 染色检测到细胞的显著增加 ( 从 5674FU±77 增加至 7143±516)。10μM 和 100μM 浓度的 达那唑没有影响， 但 LY294002 显示几乎完全弱化了细胞侵入 (5814±153)。这些数据显示 FCS 中存在的因素引发了由 HUVEC 生产的蛋白酶， 该蛋白酶降解了细胞外基质， 然后沿趋化 梯度迁移。达那唑对于本模型中的 HUVEC 的侵入和迁移没有明显地抑制效果。
在划痕迁移分析 (scratch migration assay) 中进行分析以确定达那唑对于 HUVEC 的迁移的影响。将传代 8 次的 HUVEC， 批号 8750( 由 Lonza 获得 )， 放置到 6 孔板 (ICSBioExpress) 的内皮生长培养基 -2(EGM-2) 完全培养基 ( 由 Lonza 获得 ) 中。在存在 5％ CO2 的条件下， 将该平板在 37℃培养箱中培养 48-72 小时以获得会合的单层。然后用微量 移液枪头 “刮下” 该单层并且用温 EGM-2 培养基清洗其两次。抽吸最终清洗培养基并且用 新鲜的 EGM-2 培养基或含有一定范围浓度的达那唑 (Sigma， #D8399) 的新鲜的 EGM-2 培养 基来替代最终清洗培养基。拍摄已受损的单层的照片并且将该平板放置在 37℃培养箱， 在 5％ CO2 中继续温育 24 小时。对孔再次拍照。利用 Adobe Photoshop 软件测量每张照片中 的间隙， 间隙的测量值通过在间隙中的像素数量来示出。
下表 1 中列出了三次单独实验的结果。 根据表 1 可以看出， 在该分析中发现 50μM、 75μM 和 100μM 的达那唑显著地抑制 HUVEC 迁移。用于该分析的 EGM-2 培养培养基与在 上述 C 部分描述的基质胶模型 (Matrigel model) 中的 FCS 相比， 含有生长因子的混合物 (cocktail)。在生长因子方面的不同可能会导致使用这两个模型得到的结果不同。
化合物 ( 一种或多种 ) 稀释剂对照 ( 乙醇 ) 达那唑 达那唑 达那唑 达那唑 达那唑
为了评估 HRP 流过液， 将 15μl 位于下部的室中的得到的溶液转移到 96 孔 ELISA 板中 ( 每个反应进行三次 )。接下来， 将 100μl 四甲基联苯胺 (TMB) 溶液 (Pierce) 添加到 每个孔中， 然后在室温下显色 5 分钟。通过加入 100μl 的 0.18N 酸性溶液终止显色。使用 设定为 450nm 减 530nm(450nm minus530nm) 的酶标仪测定每个孔的 OD。 与对照比较计算渗 透性的抑制比例， 并且将三组单独实验的平均值列在表 2 中。
根据表 2 可以看出， 在 25.0μM 或更高的达那唑浓度实际上增加了血管通透 性。10.0μM 浓度对于血管通透性的影响非常小或没有影响。在达那唑浓度为 0.1μM ～ 5.0μM， 其中 0.1μM ～ 0.5μM 为最佳时， 达那唑降低了血管通透性。该剂量响应曲线非常 有意思， 因为其在 0.001μM( 或可能更低 ) ～ 0.005μM 的浓度时存在抑制的第二峰值。因 此达那唑针对血管通透性显示了非常有意思并且出乎意料的剂量响应曲线 所示， 需要达那唑的浓度为 50μM ～ 100μM 使得在达那唑温育 18 ～ 24 小时后实现对 HUVEC 增殖、 迁移和管形成的抑制。如实施例 2 所示， 在 24 小时后， 抑制血 管发生的这些最佳浓度可能显著地增加血管通透性 ( 参见表 2)。相反地， 用于抑制血管通 透性的最佳浓度 (0.1μM ～ 0.5μM) 在 24 小时会显著影响血管发生。
然后将细胞接种位于 24 孔板的孔中的植入物 (1 微米孔径 )(Greiner BioOne 24-well Thincert 细胞培养植入物， #662610) 上， 在 300μl EGM-2 完全培养基中 ( 由 Lonza 将该平板在 37℃ 获得 )。 然后将 700μl EGM-2 放入到下部的室中， 在存在 5％ CO2 的条件下， 培养箱中培养 48 小时以获得会合的单层。针对所有的植入物， 使用附着在 EVOM2 伏欧表上 的 STX 100 电极 ( 两者均来自于 World Precision Instruments) 进行跨内皮电阻 (TER) 检测以确认半渗透屏障的建立。 为了进行测量， 每个探针放置在每个孔中， 其中一个电极位 于上部的室中一个电极位于下部的室中。
然后， 按照下述步骤重复地处理细胞两次。缓慢的从植入物中倾倒出 EGM-2 培养 基， 并替换为含有 0.5％胎牛血清和除了 VEGF 和氢化可的松之外的 EGM-2 添加物 ( 均来自 Lonza)。在一些孔中， IMDM 培养基含有以 10 倍逐级稀释的一系列达那唑 (Sigma， #D8399)。 在向每个孔的上部的室中加入 30μl 含有 4％荧光标记的人血清白蛋白之前， 在 5％ CO2 下， 将该平板在 37℃培养箱中温育 4 小时。在 37℃培养箱中在 5％ CO2 存在下， 再温育该平板 18 小时。
在上述温育之后， 移出植入物并丢弃， 并将 200μl 培养基从下部的室转移到 96 孔 黑色荧光 - 板 (Falcon) 中， 重复三份。然后在 340nm 的激发波长和 470nm 的发射波长检测 每个孔的荧光。然后计算每个植入物的平均荧光单位 (Mean fluorescence unit)(FU)， 对 两次重复读数取平均。结果列在表 3 中。
下表 7 中列出结果。可以看出， 所有浓度的达那唑均引起 Akt 磷酸化 ( 活化 ) 的 增加。
相信这些结果提供了对于实施例 2 中得到的血管通透性剂量响应曲线的可能的 解释。如实施例 2 所示的， 低剂量的达那唑降低渗透性， 而高剂量则增加渗透性。相信在 S473 的一定水平的 Akt 磷酸化会减低渗透性 ( 本实验中的 0.5-5.0μM 浓度 )， 而在 S473 的 Akt 的高度磷酸化会引起渗透性的增加 ( 本实验中的 10-50μM 浓度 )。
实施例 6 ： 达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的 TER 的影响
然后， 缓慢地倾倒出培养培养基， 并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的 EGM-2。添加剂为达那唑、 羟基氟他胺 ( 雄激素受体拮抗剂 )、 氟维司群 ( 雌激素受体拮抗 剂 ) 和 PI3 激酶抑制剂 LY 294002( 对照 )。所有添加剂的储备溶液， 除了达那唑之外， 均配 制成 10mM 在 DMSO 中。达那唑储备溶液为 10mM 在乙醇中。利用相同的溶剂制备所有添加 剂的工作 200μM 稀释液。然后， 在 EGM-2 培养基中配制每种添加剂的 200nM 稀释液， 以及 乙醇和 DMSO 的等量稀释液 ( 对照 )， 将达那唑和其它添加剂中的每一种或培养基 ( 对照 ) 添加到孔中， 且下表中示出了终浓度。 然后将该平板放置在培养箱中， 针对每个植入物在 30 分钟、 60 分钟、 120 分钟和 24 小时采用上述的方法进行 TER 检测。通过从植入物的读数中 减去背景测量值并再除以植入物的表面积 (0.33cm2) 从而计算 TER。结果列在下表 8 中。
从表 8 中可以看出， 与对照相比 ( 无治疗 )， 达那唑和氟维司群提高了 TER 测量值 ( 降低了渗透性 )， 而羟基氟他胺降低了读数 ( 提高了渗透性 )。达那唑阻止了由羟基氟他 胺引起的降低。上述结果可以是在这些细胞中达那唑占领雄激素受体的证据。在相同的时 间点， 达那唑和氟维司群显示出累加的效果。
细胞旁途径的 IEJ 包括 AJ 和 TJ。肌动蛋白细胞骨架与每个连接 (junction) 结合 并且通过肌动蛋白骨重塑控制连接的完整性。 肌动蛋白丝重组到张力丝中在连接上施加机 械力， 将它们撕开， 导致形态上的细胞收缩和变化。肌动蛋白的聚合过程是非常动态的， 从 而使得肌动蛋白结构快速重组并且由静止表型 (quiescent phenotype) 转换， 静止表型的 特征在于具有后的皮质的肌动蛋白环和不具有张力丝， 而活化的细胞表型具有细或非皮质 的肌动蛋白 (no cortical actin) 以及具有大量张力丝。看起来肌动蛋白细胞骨架还可能 通过调节细胞膜穴样凹陷的移动涉及转胞吞作用。
100μl PBS 清洗两次， 并且将 PBS 中的罗丹明标记鬼笔环肽 (Invitrogen)1 ∶ 40 稀释液 50μl 加入到细胞中， 对 F- 肌动蛋白进行染色， 并将该细胞放置在室温下 20 分钟。 然后， 所 有的孔均用 100μl PBS 清洗两次。之。
