米乐M6官网登录入口Nature子刊：遗传疾病治疗新希望关注基因编辑现状、问题和展望
在过去的十年中，CRISPR-Cas基因编辑系统彻底改变了生物学研究，为人类遗传疾病的治疗带来了巨大的希望。2023年初发表于Nature Communications的一篇综述，系统介绍了CRISPR-Cas9/Cas12/Cas13系统、DNA碱基编辑器先导编辑器和RNA碱基编辑器的发展情况，评估了其编辑精度、安全性以及局限性，并介绍了它们未来在基础研究和临床治疗中改进和应用的机会。
基因组编辑涉及精确、高效地操纵人类基因组内的DNA序列，以改变细胞命运和生物性状，有可能治愈遗传病。CRISPR-Cas9（规律成簇的间隔短回文重复相关蛋白9）是原核生物在长期演化中形成的用来对抗病毒或外源DNA入侵的适应性免疫防御机制。2012年，研究人员首次报道改造后的CRISPR/Cas9系统可实现快速、特异和高效地切割真核细胞DNA。此后，CRISPR-Cas系统在动物、植物等多个物种中的基因编辑能力被相继证实，推动了生命科学的重大进展。其中CRISPR-Cas9 /Cas12是应用最广泛的基因组编辑器。
第二类CRISPR-Cas系统被分为3种类型，即II型、V型和VI型，其相应的效应蛋白分别为Cas9、Cas12和Cas13。其中，大多数Cas9和Cas12变异体具有DNA核酸内切酶活性，而Cas13变异体表现出优先的RNA靶向性和切割活性。除靶向切割外，CRISPR-Cas12/13核酸酶对非靶向DNA/RNA模板也具有侧支切割活性。
虽然CRISPR-Cas核酸酶的靶DNA特异性是由向导RNA确定的，但Cas蛋白可通过向导（脱靶异源双链）内的一系列非经典碱基配对相互作用结合并部分切割互补脱靶序列，因此在临床应用中使用它们引起了安全性问题，并且迫切需要系统识别这些脱靶事件。简而言之，潜在的CRISPR-Cas核酸酶脱靶位点的全基因组识别和鉴定方法可分为三大类：
但是，没有一个工具可以准确预测所有脱靶编辑事件，尤其是低频事件。推测的脱靶位点需要通过靶向深度测序进行进一步验证，靶向深度测序是验证核酸酶诱导的插入缺失/突变存在的金标准方法。除靶向深度测序外，其他验证方法如CUT-PCR和TIDE/TIDER受其验证深度和灵敏度的限制。尽管如此，通过SURRO-seq和改进的双靶点系统对候选脱靶位点文库的整合，使我们能够在基因组和细胞背景下对识别出的CRISPR-Cas核酸酶脱靶进行大规模验证，但这些方法仍可能无法完全模拟基因编辑疗法在靶细胞中预期的编辑器递送和染色质状态。
虽然利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑在治疗人类遗传病方面有很大前景，但它可能产生超出预期的遗传改变。较为罕见的情况是，CRISPR-Cas9诱导的DSB可导致较大的基因组重排，包括大片段染色体缺失、倒位或易位，甚至更可怕的事件，如染色体畸变、非整倍体、染色体丢失和p53激活，这些事件可富集致癌细胞。CRISPR-Cas9编辑的其他结果包括外源性序列的整合，包括慢病毒、腺相关病毒(AAV)、质粒和小DNA片段。这些事件利用了CRISPR-Cas9系统产生的频繁DSB，从而有利于通过微同源性介导的末端连接（MMEJ）插入外源性DNA片段。虽然染色体重排可能是罕见事件，但令人担忧的是，即使是携带这些有害事件的极少量CRISPR-Cas9编辑细胞也可能在体内克隆扩增并导致疾病。
减少脱靶效应的方法是优化CRISPR-Cas系统的不同组分。选择具有高编辑效率和低脱靶活性的sgRNA可能是提高安全性的首选策略，尤其是在临床应用中。此外，为了减少CRISPR核酸酶诱导的脱靶效应和基因组重排，同时保持稳健的靶内活性，研究者们还开发了几种修饰方法，包括sgRNA修饰、Cas9蛋白优化、Cas9系统修饰和递送改进。
许多基因组编辑器需要引入精确的点突变、小片段插入或缺失，以纠正人类基因组中的致病性突变。目前已开发出两类DNA碱基编辑器，即胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），用于在不需要DSB或供体DNA模板的情况下精确进行靶点突变。
在CBE中，胞苷脱氨酶APOBEC/AID与切口酶 Cas9融合，通过sgRNA进行靶向，并与UGI融合，以提高碱基编辑的准确性和效率，将C•G碱基对转换为T•A碱基对。在ABE中，实验室进化出的TadA脱氨酶与Cas9 切口酶融合，将A•T碱基对转化为G•C碱基对。同样，C-to-G碱基编辑器由Cas9切酶、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶- DNA糖基化酶（Ung）组成，可将C•G碱基对转换为G•C碱基对，扩大了碱基编辑器的编辑范围。
虽然与CRISPR-Cas系统相比，DNA碱基编辑器可能是更精确的工具，但对其脱靶效应的敏感和无偏倚检测对于BE应用于人类治疗仍然很重要。CBE和ABE的脱靶活动有两种类型：一种是由给定的错配耐受范围内的序列相似引起的CAS依赖性脱靶事件，另一种是由脱氨酶与脱靶位点的非靶向结合引起的CAS非依赖性脱靶事件。
在全基因组脱靶分析（GOTI）的帮助下，Yang实验室表明，在小鼠胚胎中，CBE产生了全基因组的大量脱靶单核苷酸变异，这些变异富集在基因组的转录区域。这些发现被Digenome-seq、EndoV-seq、Orthogonal R-loop assay和CROss-seq进一步证实和扩展，表明ABEs也可以以低得多的频率产生全基因组脱靶。
除了DNA脱靶外，全转录组RNA-seq也被用于检测RNA水平的脱靶。三个独立的研究小组表明，CBE和ABE均可在人类细胞中引起大量脱靶RNA SNV，这与脱氨酶APOBEC1或TadA的RNA编辑能力一致。
基于NGS的高通量检测方法，如Excision-seq、dU-seq、UPD-Seq、U-DNA-Seq和AI-seq可以捕获脱氧尿嘧啶核苷（dU）。一种更先进的技术Detection -seq能够追踪CBE的在靶和脱靶编辑事件，这一点最近得到了类似技术Ucaps-seq的验证。在机制上，Detect-seq使用体外重建的碱基切除修复（BER）反应来实现dU的特异性标记，在此期间，正常的dTTP或dCTP被生物素- dUTP或5fdCTP取代，从而分别允许含有dU的DNA的生物素下拉或串联的C-to-T转换（用于放大信号）。除了依赖Cas9和不依赖cas9的脱靶外，Detect-seq还发现了原间隔序列外的CBE编辑（原间隔序列外编辑）和未编辑链上的CBE编辑（目标链编辑），这说明CBE可诱导近端脱靶突变。
DddA 衍生的线粒体碱基编辑器（DdCBE）是分裂 DddA 半部分和转录激活因子样效应器（TALE）阵列蛋白的融合体，可实现线粒体 DNA 中的靶向 C·G 到 T·A 转换。有趣的是，使用同样的技术，Detect-seq发现DdCBE可以以依赖或不依赖TALE阵列序列（TAS）的方式在核基因组中诱导大量脱靶编辑。
减少DNA碱基编辑器脱靶效应的策略与CRISPR-Cas系统相似，包括改良的向导RNA、工程化的Cas9、改进递送以及工程化的高保真胞苷或腺苷脱氨酶。
将高保线-HF，HypaCas9和切口酶形式的SuperFi-Cas9，整合到BE架构中，可以减少Cas依赖性的脱靶效应。将脱氨酶（APOBEC1或TadA）引入到Cas9n的耐受位点（而不是nCas9的N端），可以显著减少DNA碱基编辑器对gRNA的非依赖性脱靶编辑。与质粒DNA/病毒递送相比，通过RNP复合物或mRNA/sgRNA或脂质纳米颗粒（LNPs）递送BE系统可产生更多的瞬时编辑活性，从而提高特异性，减少脱靶效应。
由于与CBE相比，ABE表现出较低的DNA和RNA脱靶活性、较小的体积和较高的靶内编辑效率，因此研究者对ABE进行了重组，以实现高效、特异的基于CRISPR的胞嘧啶碱基编辑。进化的TadA胞嘧啶脱氨酶在DNA结合残基上发生突变，改变了酶的选择性，使脱氧胞嘧啶脱氨比脱氧腺苷脱氨更倾向于脱氧胞嘧啶，这是除天然AID/APOBEC蛋白家族之外的第一个非天然胞嘧啶脱氨酶。简而言之，Td-CGBE可以高效、精确地进行C-to-G编辑，而Td-CBEs和TadCBEs通过UGI和其他突变的融合产生精确的C-to-T碱基转换。此外，TadA双碱基编辑器（TadDE）被证明可以同时进行同样高效的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑（C-to-T和A-to-G），可以实现饱和诱变和筛选。
PE可以实现精确的基因组编辑，包括靶向小片段插入、小片段缺失以及所有12种可能的点突变及其组合，而不需要DSB或供体DNA模板。 PEs使用Cas9 切口酶 （H840A）与经过工程改造的莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶（RT）融合，后者由所需的包含编辑的pegRNA进行编程。（PBS）和逆转录酶的逆转录RNA模板（RTT），用于在目标位点生成所需的编辑。
由于PE3中的两个切口可能产生潜在的DSB，因此在PE3编辑的靶位点上观察到一定水平的基因组片段、质粒和LINE-1插入，但其频率远低于CRISPR-Cas9系统。同样，使用两个pegRNA也可以产生DSB。因此，需要仔细评估其脱靶和非预期的靶向效应。有研究表明，pegRNA是在sgRNA的基础上,对其3′端进行延长,增加逆转录模板（RTT）和引物结合位点（PBS），可以进入tracrRNA支架，导致在初始编辑位点出现大量支架序列插入。因此，将pegRNA分裂成sgRNA和一个单独的RTT-PBS序列（线性或圆形）不仅可以防止3 延伸的pegRNA被核酸酶降解，而且可以减少pegRNA支架的插入。
同时，对启动编辑器的Cas依赖性和非依赖性脱靶效应进行了研究。基于切口酶的Digenome-seq、CROss-seq和TAPE-seq用于筛选PE系统的全基因组依赖Cas的脱靶位点，研究表明PE提供高度特异性的基因组编辑，脱靶非常有限，可以通过高保线变体进一步改善。另一方面，最近的三项研究表明，在基因组和转录组水平，PE3在植物或人类细胞中均未诱导显著的Cas非依赖性脱靶突变/重排，这表明其逆转录酶部分具有高度的编辑特异性。
携带单效应蛋白Cas13的第2类VI系统是已知唯一靶向RNA的CRISPR-Cas系统，这显示出其作为敲低、检测和RNA编辑工具的前景。Cas13由两个HEPN结构域组成，它们共同形成一个复合RNase活性中心，负责催化靶RNA结合后的RNA裂解。Cas13a、Cas13b、Cas13d介导的RNA降解和基因敲低相对于RNA干扰表现出高效率和特异性，使得包括神经疾病和致病病毒在内的潜在治疗方法成为可能。
有趣的是，活化的Cas13-crRNA复合物可切割靶RNA（顺式切割）和非靶侧支RNA（反式切割），使灵敏的核酸检测和诊断成为可能。例如，基于Cas13开发出SHERLOCK技术，适用于检测 SARS-CoV-2 的更新版本称为 STOP。另一方面，CRISPR-Cas13系统对周围的任意RNA的侧支降解限制了其在体内的应用。因此，开发具有最小附带效应的高保线变异体，可能进一步提高其在基础研究和治疗应用中靶向降解RNA的效力。
研究者将催化失活的Cas13蛋白（dCas13）与ADAR2融合，开发出RNA碱基编辑器，例如REPAIR（可实现高效的A I RNA单碱基编辑）和RESCUE（在保留原有的A I编辑能力外，还增加了C U的RNA单碱基编辑方式）。之后，为了进一步提高了REPAIR的特异性，研究人员对其进行了一系列的修饰，使其成为REPAIRv2系统。结果表明，REPAIRv2系统可把全转录组中的可检测脱靶编辑数从18385降低到20，并且编辑RNA的效率最高可达51%。2019年1月，Stafforst及其同事们报道了一种称为RESTORE的RNA编辑方法，它的作用机制是使用经过复杂化学修饰的化学合成反义寡核苷酸来招募内源性的ADAR。同年7月北京大学魏文胜课题组描述了一种使用内源性ADAR进行RNA编辑的替代方法，称为LEAPER，可利用经过改造的arRNA招募天然的ADAR1或ADAR2酶，从而将特定的腺苷转变为肌苷。
由于基因编辑方法仍处于临床开发的早期阶段，并且尚未有任何基于CRISPR的疗法被批准用于患者，因此这些方法的安全性和相关临床风险尚不确定。虽然越来越多的技术可用于对靶点和脱靶基因组效应进行分类，但体细胞遗传修饰本身可能并不预示临床后果。随着时间的推移和细胞分裂，细胞自发地积累DNA损伤，因此体细胞遗传变异获得的一次性适度增加可能不是特别显著。
总体而言，大多数遗传变异体预计为中性，少数可能对细胞有害的变异体在临床上无关紧要。相比之下，最令人担忧的是那些通过激活癌基因或破坏肿瘤抑制因子来促进克隆扩增和致瘤性的功能获得性变异。但目前为止，在临床研究中还没有报道治疗性基因编辑的出现意外致瘤性，这表明这些影响的频率可能极低。
最后，临床考虑因素必须扩展到整个治疗性基因编辑程序，包括细胞递送和宿主应答的任何附带风险。比如体内基因转移载体可能引起的不必要的宿主反应，如干扰素反应和DNA损伤反应。
CRISPR-Cas系统在基因组编辑和RNA编辑领域取得的进步，为基础研究和治疗应用的发展铺平了道路。但目前可用于检测CRISPR-Cas系统脱靶效应的方法仍然不完善。此外，目前还缺乏经过验证和批准用于临床的方法。未来的工作需要为更精确、更高效和更安全的编辑工具奠定基础。
