用于疾病治疗米乐M6官网登录入口的方法与流程

　　导航：X技术最新专利医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术

　　1.本技术是申请号为0.6的中国专利申请的分案申请，该母案的申请日为2016年8月26日，发明名称为“用于疾病治疗的方法”。

　　119(e)，本技术要求2015年8月28日提交的临时专利申请系列号62/211,296的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

　　web提交，并且据此全文以引用方式并入。创建于2012年12月31日的所述ascii副本，名称为65292741.txt，并且大小为18,884字节。

　　6.本公开提供利用分离和/或合成的具有出人意料的细胞保护特性的肽来治疗疾病的新方法，所述疾病包括急性心肌梗死(ami)；痛风；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；中毒性休克和心脏手术并发症。

　　8.在美国和世界范围内，急性心肌梗死(ami)一直是发病率及死亡率的主要原因。尽管当前早期再灌注的策略，许多患者仍在此期间早期死亡，并且存活的那些患者面临后期死于不利心脏重构、心力衰竭和突然死亡的风险。

　　10.患有st段抬高性心肌梗死(stemi)的患者尤其面临不利心脏重构、心力衰竭以及医院内和长期死亡率的高风险。虽然在stemi的治疗方面已经有了显著的改善，但是早期死亡率的降低已经与stemi后心力衰竭的发生率提高关联在一起。这可能反映了幸免于指示事件的更高风险患者以及人群老化和高血压及糖尿病的流行。在stemi的30天内，超过20％的幸存者诊断患有心力衰竭，这是一种与高发病率、失能和死亡率相关联的疾病。

　　11.心力衰竭确实是主要的公共健康问题，影响大约5百万美国人，并且每年新增500,000例。与其它心血管疾病相比，心力衰竭的发生率和普遍性持续提高，并且心力衰竭现在是65岁人群的首要住院原因，所述人群也是快速增长的人口区段。虽然发生心力衰竭后的存活率也得到改善，但当前的疗法可减缓而非终止疾病的发展。受到功能容量、呼吸困难和疲劳的进行性症状、频繁入院和丧失生产能力的经济后果、以及增加的医疗护理成本的限制，心力衰竭对医疗保健强加了重大负担。

　　12.对开发用于最小化梗死面积并在ami后预防心力衰竭的其它治疗存在迫切的需要。当前对stemi的治疗包括通过恢复冠状动脉开放(即，血管成形术或纤维蛋白溶解)对缺血心肌的快速再灌注、预防再栓塞(即，抗血小板剂和抗凝剂)、和神经激素阻断(即，肾素

　　醛固酮和肾上腺素能阻断剂)。虽然这些干预各自提供增加的益处并且显著降低了发病率及死亡率，但在stemi后心力衰竭的发生率持续提高，表明当前的治疗范式仍遗

　　13.因此，确定尽管最佳治疗但不利的心脏重构和心力衰竭仍然发展的机制是研究新干预方法的关键步骤，最终目标是减少stemi后心力衰竭的发生率、负担和死亡率。

　　末端肽(例如短肽，sp16(seq id no：1))及其变体和衍生物作为有效的细胞保护剂在治疗与细胞因子风暴和/或梗死相关联的病症如ami中起作用。以前已经表明这些肽具有抗炎特性(参见例如美国专利8,975,224)，这使得它们在治疗由于细胞因子风暴和/或梗死导致的细胞死亡相关联的病症中的功效出人意料。在相关的病症中，虽然未受控的炎症可能有助于疾病进程，但炎症依然是恢复所需的关键过程。这由以下事实证明：调节炎性反应作为例如急性心肌梗死(ami)的治疗的许多尝试已经失败了。

　　16.相比之下且意外地，本文所述的肽：1)允许对炎性反应的治疗调节，2)提供细胞保护效应，并且3)减少梗死面积。这种活性组合提供治疗与细胞因子风暴和/或梗死相关联的病症的令人惊讶且意外的功效。如本文实施例所述，这种令人惊讶的功效与例如il

　　末端丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽的药物组合物、以及使用所述肽治疗病症(包括与细胞因子风暴相关联的病症)和/或减少发生在多种病症(其中细胞保护是需要的)中，例如在与缺血再灌注损伤以及导致的病理的风险相关联的病症中的梗死的方法。这些肽的意外的细胞保护特性允许将包含此类肽的组合物用于新适应症，并且允许在与例如缺血再灌注损伤相关联的病症中进行预防性干预。

　　18.具体地，已经显示了在充分确立的急性心肌梗死(ami)动物模型中由氨基酸序列vkfnkpfvflmieqntk(seq id no：1)组成的sp16肽或者sp163mvkfnkpfvflnleieqntk的新细胞保护功能。

　　19.因此，提供了包含分离的肽的组合物的新用途，所述肽包含氨基酸序列x1

　　25.z3为任意五个氨基酸的序列，并且其中分离的肽由37个或更少的氨基酸组成。

　　26.可利用一种或多种非天然的肽键或氨基酸或者通过附接到肽官能团如聚乙二醇(peg)，修饰所述肽以延长贮藏期限和/或生物利用率。

　　28.在本文所述的任何实施方案的一个方面是如下方法：1)治疗与细胞因子风暴相关联的疾病，2)减少梗死面积，和/或3)治疗急性心肌梗死(ami)，该方法包括将包含肽的药物组合物给予患有疾病的人类受试者，所述肽选自：

　　35.z3为任意五个氨基酸的序列，并且其中所述肽包含37个或更少的氨基酸；

　　36.(b)包含氨基酸序列vkfnkpfvflmieqntk(seq id no：1)的肽；

　　47.(d)基本上由氨基酸序列rfnrpflr(seq id no：4)组成的肽；

　　48.(e)基本上由氨基酸序列rrrfnrpflrrr(seq id no：8)组成的肽；

　　49.(f)基本上由氨基酸序列vkfnkpfvflmieqntk(seq id no：1)组成的肽；

　　50.(g)基本上由氨基酸序列fnrpfl(seq id no：10)组成的肽；以及

　　52.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关联的疾病选自急性心肌梗死(ami)；痛风；中风；心脏手术并发症；外伤性脑损伤；急性呼吸窘迫综合征(ards)、败血病、埃博拉病毒(ebola)、禽流感、天花和全身炎性反应综合征(sirs)。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，需要减少梗死面积的人类受试者是需要治疗选自以下的疾病的受试者：急性心肌梗死(ami)；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；和中毒性休克。

　　54.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，肽还包含至少一种第二肽或蛋白。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，至少一种第二肽或蛋白作为融合肽连接到所述肽上。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，至少一种第二肽或蛋白是表位标签或半衰期延长剂或二者。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽包含一种或多种d

　　55.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽当以有效量给予人类受试者时，引起血清tnf

　　56.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽由35个或更少的氨基酸残基组成。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽由22个或更少的氨基酸残基组成。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽由21个或更少的氨基酸残基组成。

　　57.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

　　58.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不患有选自以下的病症、不患有选自以下的病症的症状、或者不诊断患有选自以下的病症：ii型糖尿病、狼疮、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、湿疹、牛皮癣、囊性纤维化病、类风湿性关节炎、急性放射综合征、烧伤、炎性肠病、i型糖尿病、和高血糖。

　　α水平的方法或用途，包括将在药学上可接受的载体中的本发明的肽给予人类个体。在某些实施方案中，与在给予分离的多肽之前的水平相比，分离的肽当以有效量给予人类受试者时导致血清tnf

　　α水平降低了50％或75％。在其它实施方案中，分离的肽还包含至少一种其它蛋白。至少两种蛋白的组合可称为融合蛋白。其它蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。所述肽可包含表位标签和半衰期延长剂二者。

　　x5(seq id no：3)，其中x1、x2、x3、x4、x5、z1、z2、和z3如上文所定义，并且其中所述肽由最多35、22或21个氨基酸残基组成。

　　71.在某些方面，本文所述并贯穿本说明书的任何实施方案的肽还包含至少一种其它蛋白。这些至少两种蛋白的组合可称为融合蛋白。具体地，其它蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽可包含表位标签和半衰期延长剂二者。

　　72.本公开还提供分离的肽，所述肽基本上由或由氨基酸序列rfnrpflr(seq id no：4)和rfnkpflr(seq id no：5)组成。在某些实施方案中，与在给予所述肽之前的tnf

　　73.在本发明的所有实施方案的其它方面，分离的肽连接另一个蛋白。这些蛋白的组合可称为融合蛋白。具体地，其它蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。

　　74.在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽由最多100、35、22、21或9个另外的氨基酸组成。

　　z2(seq id no：7)组成，其中z1和z2独立地为1个、2个、3个、4个、5个、

　　6个、6个、7个、8个、9个、10个或1至3个、1至5个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个、或1至10个碱性氨基酸。

　　76.在一些实施方案中，分离的肽基本上由或由氨基酸序列rrrfnrpflrrr(seq id no：8)和rrrfnkpflrrr(seq id no：9)组成。

　　77.本公开还提供包含分离的肽的组合物，所述肽基本上由或由氨基酸序列fnrpfl(seq id no：10)和fnkpfl(seq id no：11)组成。

　　78.本公开还提供了包含分离的或合成的肽的组合物，所述肽基本上由或由任意一种以下肽或以下肽的组合组成：如表b中列出的sp40、sp43、sp46和sp49；和它们在以下方法中的用途：1)治疗与细胞因子风暴相关联的疾病，2)减少梗死面积，和/或3)治疗急性心肌梗死(ami)。

　　79.在本文所述的任意方面的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关联的疾病选自急性心肌梗死(ami)；痛风；中风；心脏手术并发症；外伤性脑损伤；急性呼吸窘迫综合征(ards)、败血病、埃博拉病毒(ebola)、禽流感、天花和全身炎性反应综合征(sirs)。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，需要减少梗死面积的人类受试者是需要治疗选自以下的疾病的受试者：急性心肌梗死(ami)；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；和中毒性休克。

　　α的方法，该方法包括向受试者给予有效量的如上所定义的任意一种分离的肽，从而将血清tnf

　　α水平降低了75％。在其它实施方案中，受试者是哺乳动物。在本发明的所有实施方案的一些方面，哺乳动物是人类。

　　81.在本发明的所有实施方案的一些方面，在给予所述肽之前，人已被诊断出患有与细胞因子风暴、ami或梗死相关联的疾病。在本发明的所有实施方案的一些方面，在给予所述肽之前，人已被诊断出患有急性心肌梗死(ami)；痛风、中风、心脏手术并发症、外伤性脑损伤、急性呼吸窘迫综合征(ards)、败血症、埃博拉病毒(ebola)、禽流感、天花、全身炎性反应综合征(sirs)、局部缺血、和/或中毒性休克。

　　82.在一些方面，在用本发明的肽治疗之前，人尚未经受用α抗胰蛋白酶如α

　　84.本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。附带彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要的费用时由专利局提供。

　　86.图2是示出来源于截短蛋白的肽的表(按出现顺序分别是seq id no：25

　　3d示出证实在小鼠中aat减少实验性急性心肌梗死(ami)的梗死面积的图和图像。图3a示出左心室中的风险面积的图。图3b示出梗死面积(左心室的％)的图。cdd.在ami后7天，用白蛋白(图3c)或aat(图3d)治疗的代表性对照小鼠的心室中间心脏切片的马松三色染色。梗死疤痕以蓝色显示。alb＝白蛋白。

　　4c示出证实sp163m的以下功效的图：减少心肌梗死面积(图4a)、降低心脏特

　　异性肌钙蛋白i(一种心肌坏死的生物标记物)的血浆水平(图4b)，并且其也通过sp16治疗显著减少(图4b)，和保持左心室收缩功能，其使用经胸超声心动图作为左心室缩短分数测量(图4c)。

　　89.图5a和5b是证实以下的图：再灌注30’给予的sp163m显著减少了梗死面积(图5a)并保持lv缩短分数(图5b)。

　　90.图6a和6b是证实以下的图：再灌注30’给予的sp163m以剂量依赖的模式减少梗死面积(图6a)并保持lv缩短分数(图6b)。

　　91.图7是证实sp163m不影响心脏收缩性的图。示出静止时(左图)或在异丙肾上腺素攻击(收缩保留)后(右图)的心脏收缩功能的测量结果。

　　92.图8示出证实sp163m减少梗死面积并有效治疗ami的图和超声心动图。

　　94.图10示出流式细胞术的图，证实sp16以剂量依赖的方式增加raw264.7鼠巨噬细胞上的lrp1表达。

　　96.图12a和12b示出sp16结合到lrp1上。当丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结合使它们失活的蛋白酶时，发生构象变化，由此暴露包含独特基序的短肽(5

　　11个氨基酸)。图12a提供示意图(自joslin g等人，j biol chem 1991和lillis a等人，physiol rev 2008改良)，以说明sp16包含aat的五肽fvflm(seq id no：1的氨基酸残基7

　　11)，其负责结合至lrp1。图12b提供sp163m而不是sp34体外结合至lrp1的证据。

　　97.图13a和13b提供sp16是lrp1激动剂的证据。sp163m抑制在thp1

　　kb信号转导，并且用lrp1封闭抗体或rap(导致lrp1下调的辅因子)处理限制sp16

　　诱导的心脏保护。小鼠用lrp1封闭抗体预处理以测试lrp1是否介导sp163m和aat的心脏保护信号。用封闭抗体处理消除了sp163m和血浆来源的aat二者的保护效应。n＝5

　　100.本公开描述分离的肽在疾病治疗和预防领域的新型且出人意料的用途，其中所述肽提供细胞保护效应。具体地，本发明描述了使用分离和/或合成的具有出人意料的细胞保护性质的肽治疗疾病的新方法，其中细胞保护是治疗疾病和/或预防病症恶化的基本组成部分，所述疾病包括例如急性心肌梗死(ami)；痛风；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；中毒性休克和心脏手术并发症。

　　101.丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)代表一个蛋白酶抑制剂的大(＞1000)家族，其存在于所有生命分支中并涉及多个生理过程。在哺乳动物如人类中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白对于内稳态是重要的，并且虽然存在一定水平的混杂，但每个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有同源的丝氨酸蛋白酶。例如，α

　　抗胰凝乳蛋白酶(act)抑制炎性蛋白酶如弹性蛋白酶，而抗凝血酶抑制凝血酶并在凝血过程中起作用。

　　102.在包括copd、血栓和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白病(硬化症和痴呆)的人类疾病中，识别了多个特异性aat突变。当前fda批准了少量的人血清来源的aat制剂用于治疗copd。在这一治疗方法中，aat起到类似于内源aat的蛋白酶抑制剂的作用。

　　103.aat是原型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，并且与其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有共同的三级结构。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有～20个氨基酸(aa)的暴露的环，称为反应性中心环(rcl)，其用作同源蛋白酶的诱饵。一旦蛋白酶结合rcl，它就被捕集、部分解折叠且注定降解。rcl在其p1

　　104.以前已经描述了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的肽片段及其衍生物，它们经测定具有抗炎特性(美国专利8,975,224)。

　　来源的肽，例如sp16，不仅具有抗炎特性，而且显示令人惊讶的细胞保护活性和减少梗死的活性。细胞保护活性和减少梗死的活性以前是未知的，并且提供了用本文所述的肽治疗某些疾病的显著且意外的优点。这通过例如以下事实得到证明：与仅具有抗性活性的化合物(例如il

　　1拮抗剂)相比，sp16在治疗ami方面具有令人惊讶的功效，提供了仅通过抗炎性无法获得的活性，导致显著改善的治疗效果。

　　106.不希望受理论的束缚，设想sp16通过干扰由缺血和再灌注引起的炎性细胞死亡(细胞焦亡)，介导本文所述的心脏保护。具体地，sp16限制急性缺血

　　再灌注损伤、限制心脏中的急性炎性反应、减少梗死面积、预防有害的心脏重构、并且预防心力衰竭。提出的sp16活性模型在图9中示出。

　　末端肽的分子，治疗与细胞因子风暴相关联的疾病和/或减少梗死面积(例如治疗ami)的方法。所述分子以有效减少梗死面积或者减轻细胞因子风暴的细胞破坏效应，诸如缺血再灌注损伤的量给予。

　　抗胰蛋白酶的sp16(seq id no：1)和sp163m(seq id no：57)不仅表现出类似于母体蛋白α

　　抗胰蛋白酶的那些的抗炎和免疫调节特性，而且用作细胞保护剂。sp16看起来是一流的肽主开关，用于治疗自体免疫、炎性和代谢疾病，并且此外具有作为细胞保护剂的意外效果。不希望受理论的束缚，基于母体蛋白α

　　抗胰蛋白酶良好的安全性，本发明的肽能够提供良好的安全性。然而，本发明的肽更易于生产并且因此生产成本更低，因为它们远小于母体蛋白。

　　109.以前已经证明，来源于由其同源的丝氨酸蛋白酶之一导致的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的裂解的c

　　末端肽具有生物学功能，该功能不同于母体(完整的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子)的蛋白酶抑制剂功能。例如，来自aat、抗胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶结合蛋白的c

　　末端肽具有不同程度的抗炎效应。基于我们当前的研究和出乎意料的成果，我们现在认为这些肽的治疗用途可从抗炎用途扩展到细胞保护用途。新功能允许目的是预防例如局部缺血的治疗。

　　110.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白以前已知的功能涉及抑制丝氨酸蛋白酶的功能。一些丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制其它类型的蛋白，并且有几种不具有抑制功能。

　　111.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个大家族(＞1000)，它们结构上类似但是功能上相异。它们涉及多个生理过程，并且对于哺乳动物的内稳态是至关重要的。在各个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白中的基因突变在不同的人类疾病中是明显的，包括copd、血栓和肺气肿。

　　112.具有抑制作用的每种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白负责阻断一种或多种蛋白的活性。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与它们的靶蛋白结合，从而防止它们完成任何进一步的反应。在与靶结合时，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的结构发生不可逆的改变。某些细胞识别何时丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与其靶结合并从血流中清除这些附连的蛋白。

　　抗胰蛋白酶(aat)是原型的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。(talecris)、(aventis behring)和(baxter)是人血清来源的aat制剂，其由fda批准用于治疗copd。aat当前在临床试验中用于治疗新发作i型糖尿病、移植物抗宿主病和囊性纤维化病。

　　114.研究人员已经在人类中鉴定了至少37种不同的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白基因。基于我们的研究，我们提出：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的分离和合成的c

　　末端片段提供具有抗炎、细胞保护和减少梗死活性的新的分子来源。因此，我们认为至少在表a中列出的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的c

　　在美国专利8,975,224中描述的肽是基于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白及其变体和衍生物的特别定义的短的分离或合成的c

　　末端肽，与天然丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相比，其令人惊讶地具有有效的抗炎性质，并且对于治疗用途而言具有有用得多的尺寸。分离的肽在图1

　　末端片段的氨基酸序列。每种肽在紧靠肽的左侧的列2中用seq id no：标示。图2示出如图1所示的c

　　末端片段的截短，以及它们的变体和衍生物。同样地，每种肽在紧靠肽的列2中用seq id no：标示。

　　丙氨酸筛选表明如下表b所示的分离或合成或经修饰的sp16肽对于降低炎症小鼠模型中的tnf

　　末端的氨基酸看起来对肽的抗炎特性起作用，因为取代它们看起来减弱所述肽降低lps攻击的败血症小鼠模型中的tnf

　　α水平的能力(参见例如pct/us13/20498；其全文以引用方式并入本文)。因此，在本发明的所有实施方案的一些方面，肽选自sp40、sp43、sp46、和sp49，

　　表b示出命名为sp16；sp40；sp43；sp46；和sp49的肽，它们当给予败血症的小鼠模型时提供尤其良好的抗炎效应。sp16、sp163m、sp37、sp40、和/或sp51结合lrp1并且如本文所述设想为细胞保护性的。在一些实施方案中，sp16、sp163m、sp37、sp40、和/或sp51可用于本文所述的方法。

　　根据本发明的一些实施方案和方面，提供细胞保护性治疗的方法包括将有效的细胞保护或梗死面积减少量的任何分离的肽给予受试者如人类受试者，所述肽由或基本上由如下所示的序列组成：seq id no：8、10、19

　　49，它们可用于本文所述的方法。由或基本上由如seq id no：8、10、19

　　α水平。还设想将如pct/us13/20498(其全文以引用方式并入本文)所述的具有降低tnf

　　α水平的能力的肽在本发明中用于组合物、药物组合物以及使用并治疗炎性病况的方法。

　　sp1(seq id no：18)；sp2(seq id no：19)；sp3(seq id no：20)；sp4(seq id no：21)；sp5(seq id no：22)；sp6(seq id no：23)；sp7(seq id no：24)；sp8(seq id no：25)；sp9(seq id no：26)；sp10(seq id no：27)；sp11(seq id no：28)；sp12(seq id no：29)；sp13(seq id no：30)；sp14(seq id no：31)；sp15(seq id no：32)；sp16(seq id no：1)；sp163m(seq id no：57)sp17(seq id no：33)；sp18(seq id no：34)。

　　短语“基本上由...组成”在本文是指将肽的范围限定于指定的材料氨基酸，并且仅包括另外的氨基酸或者改变，其实质上不影响本发明的基本特性和新特性，即，短的分离或合成肽的抗炎能力。该定义明确排除了具有完整的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白序列的肽，并且该定义也明确排除了等于或大于37个氨基酸的任何天然存在的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的肽序列。

　　不希望受理论的约束，也已经鉴定了提供核心的重要氨基酸，和对于例如如本文所制造的抗炎肽可能的修饰。也提供了由如下文所示的式涵盖的分离的肽，并且它们可用于减少炎症、治疗细胞因子风暴、提高细胞存活率、和/或减少梗死面积。

　　已知人aat、抗胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶结合蛋白包含具有抗炎特性的某些组分。然而，这些组分以前尚未得到鉴定。目前已经使用例如小鼠内毒素血症模型(lps诱导的内毒素血症)确定了一个人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白来源的肽的新家族，其具有有效的抗炎效果。基于肽在小鼠炎症模型中的功效、肽的大小、以及母体蛋白的安全特征，基于aat的肽、诸如sp16的肽、以及它们的片段和衍生物提供了一个新型且改善的分子，用于治疗人的炎症。

　　式i提供包含肽的组合物，所述肽包含、基本上由或由以下氨基酸序列组成：x1

　　在所有实施方案的某些方面，分离的肽当以有效量给予人类受试者时，与在给予所述分离的肽之前测得的血清水平相比，引起血清tnf

　　α水平降低50％或75％。在本发明的所有实施方案的一些方面，肽还包含融合蛋白。融合蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂或它们的组合。

　　式ii提供了包含分离的肽的组合物，所述肽包含、基本上由或由以下氨基酸序列组成：x1

　　z3是任意五个氨基酸的序列；并且其中分离的肽当以有效量给予人类受试者时，与在给予分离的肽之前的血清水平相比，引起血清tnf

　　x5(seq id no：3)的肽包括最多35、22或21个氨基酸残基。在本发明的所有实施方案的某些方面，肽还包含融合蛋白。具体地，融合蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂或它们的组合。

　　在本发明的所有方法及应用的一些方面，肽可包含seq id no：57的肽。在本发明的所有方法及应用的一些方面，肽可基本上由seq id no：57的肽组成。

　　因此，本发明也提供涉及分离的肽的方法及应用，所述肽由或基本上由氨基酸序列rfnrpflr(seq id no：4)和rfnkpflr(seq id no：5)组成，它们也可用于治疗炎症。在某些实施方案中，肽当以有效量给予人类受试者时，与在给予所述分离的肽之前的血清tnf

　　α水平降低50％或75％。在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽还包含融合蛋白。具体地，融合蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。在其它实施方案中，分离的肽包含最多100、35、22、21、16或9个氨基酸。在其它实施方案中，分离的肽包含氨基酸序列z1

　　z2(seq id no：7)，其中z1和z2独立地为1个、2个、3个、4个、5个、6个、6个、7个、8个、9个、10个或1至3个、1至5个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个、或1至10个碱性氨基酸。

　　在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽基本上由或由氨基酸序列rrrfnrpflrrr(seq id no：8)和rrrfnkpflrrr(seq id no：9)组成。本公开也提供包含肽的组合物，所述肽基本上由或由氨基酸序列fnrpfl(seq id no：10)和fnkpfl(seq id no：11)组成。

　　在某些实施方案中，分离的肽包含5个或更多个连续氨基酸，它们来自氨基酸序列flmieqntk(seq id no：36)。这些肽可用于为受试者减轻炎症、提高细胞存活率、治疗细胞

　　在一些方面，治疗方法还包括在给予分离的肽之前和在给予分离的肽之后分析tnf

　　α血清水平的降低少于30％，可用与第一剂量相同剂量或比第一剂量更大剂量的肽重复所述给予步骤。

　　任何上述肽的片段的大小可不同。例如，这些片段的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或37个氨基酸。

　　除治疗与细胞因子风暴相关联的疾病和/或减少梗死面积之外，上述肽还能够例如治疗ami，减轻炎症。所述肽具有抗炎和免疫调节效应，并且另外直接或间接地刺激β细胞再生。在某些实施方案中，这些肽通过降低tnf

　　α的活性可降低10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％。tnf

　　α的表达可降低10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％。当用于治疗给予时，所述肽组合物通常还包含药学上可接受的溶液或载体。

　　上文所述的肽也可用于治疗、预防或改善若干病理的症状。因此，本公开还提供治疗与细胞因子风暴相关联的疾病的方法或减少梗死面积的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者给予任意一种本文所述的肽或它们的组合的步骤。在一些方面，受试者在所述治疗前尚未用α

　　抗胰蛋白酶进行过治疗。在一些方面，所述方法包括以下步骤：检测是否所述个体具有提高的血清tnf

　　本公开也使得预防与细胞因子风暴相关联的疾病发展或预防梗死面积增加的方法变得可行，所述方法包括以下步骤：将任何一种所述肽或它们的组合给予需要预防与细胞因子风暴相关联的疾病或预防梗死面积增加的受试者。在一些方面，受试者在所述治疗前尚未用α

　　抗胰蛋白酶进行过治疗。在一些方面，所述方法包括以下步骤：检测是否所述个体具有提高的血清tnf

　　α水平，则不将肽给予受试者。在本发明的所有实施方案的一些方面，有需要的受试者以前尚未用任何如本文所述的肽对任何病症进行过治疗。

　　在本发明的所有实施方案的一些方面，治疗的首要目的是为了治疗或预防与以下疾病效应后的损害相关联的非期望的细胞死亡和组织退化：急性心肌梗死(ami)；痛风；中风；心脏手术并发症；外伤性脑损伤。在此类应用中的有效剂量通过测定对预防或改善缺血再灌注损伤的效应进行测量。所述剂量不一定与单独治疗炎症的剂量相同。效果也可通过测定例如在特定器官或组织中的细胞活力和/或细胞死亡的水平进行测量。

　　为方便起见，在整个专利申请(包括说明书、实施例、以及所附权利要求书)中使用的某些术语的定义贯穿整个说明书。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域(本发明所属的领域)普通技术人员通常所理解的相同的含义。

　　术语“野生型”分别是指天然存在的编码蛋白的多核苷酸序列或其部分、或者蛋白序列或其部分，如它在体内正常存在的。

　　术语“突变”是指在生物体的遗传物质中的任何变化，尤其是在野生型多核苷酸序

　　列中的变化或在野生型蛋白序列中的变化(即，缺失、取代、添加、或改变)。虽然通常认为遗传物质中的变化导致蛋白功能的变化，但术语“突变”是指野生型蛋白序列中的变化，无论是否该变化改变了蛋白功能(例如提高功能、降低功能、赋予新功能)，或者是否该变化对蛋白功能无效应(例如突变或变异是沉默的)。在本专利申请中，术语突变与多态性在本文可互换使用。

　　除非另外定义，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指分离的氨基酸残基聚合物，并且不受最小长度的限制。肽、低聚肽、二聚体、多聚体等等也由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成，并且无论是生物产生并分离自天然环境、利用重组技术产生、还是通常利用天然存在的氨基酸合成产生。

　　在一些方面，多肽或蛋白是包含非天然存在的氨基酸的“修饰多肽”。在一些方面，多肽包含天然存在的和非天然存在的氨基酸的组合，并且在一些实施方案中，所述肽仅包含非天然存在的氨基酸。

　　在本发明的所有实施方案的一些方面，所述肽或修饰肽还包含共翻译和翻译后(c

　　末端肽裂解)修饰，例如形成二硫键、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解裂解(例如通过弗林蛋白酶(furin)或金属蛋白酶进行裂解)等等，所述修饰达到以下程度：此类修饰不影响分离肽的抗炎特性或它们改善血糖控制的能力。

　　在本发明的一些方面，改变了所述多肽。术语“改变的多肽”是指包括对天然序列的改变诸如缺失、添加、和取代(性质一般是保守的，如本领域技术人员已知的，例如丙氨酸)的肽，只要蛋白保持期望的活性即可，即，保持它的抗炎活性，能够改善血糖控制或降低高血糖。这些修饰可为故意的，例如通过定点诱变，或者可为偶发的，例如通过产生蛋白的人工宿主如基因工程化的细菌、酵母或哺乳动物细胞的突变，或者由于pcr扩增或其它重组dna方法导致的错误。多肽或蛋白由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成，但是相对于肽具有确定的构象。与肽相反，蛋白一般由50或更多个氨基酸的链组成。

　　如本文所用，米乐M6官网登录入口术语“肽”通常是指由通过肽键连接的氨基酸单链构成的氨基酸序列。除非另外定义，一般来讲肽包含至少两个氨基酸残基并且长度小于约50个氨基酸。

　　[0170]“经修饰的肽”可包括将非天然氨基酸掺入本发明的肽，这包括在某些情况下按需将合成的非天然氨基酸、取代氨基酸、或者一种或多种d

　　氨基酸掺入所述肽(或者除蛋白酶识别序列之外的该组合物的其它组分)。与包含l

　　氨基酸的肽在体内或体外表现出提高的稳定性。因此，当期望或需要在体内或细胞内更大的稳定性时，构造掺入d

　　肽对内源肽酶和蛋白酶具有抗性，从而提供更好的关联药物及缀合物的口服跨上皮和透皮递送、改善的膜持久复合物的生物利用率(参见下文详述)、以及延长的血管内和间质寿命(在需要这样的特性时)。使用d

　　异构肽也能够促进关联药物和其它货物分子的透皮和口服跨上皮递送。另外，不能有效加工d

　　肽用于t辅助细胞的主要组织相容性复合体ii类限制呈递，且因此不太可能在整个生物体中引发体液免疫反应。肽缀合物可因此利用例如细胞穿透肽序列的d

　　异构体形式进行构造。因此，在一些实施方案中，公开的所述肽包含l和d氨基酸，其中包括不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个d

　　翻转类似物具有相反的末端和相反的肽键方向，同时大体上保持天然肽序列中的侧链的拓扑结构。反向

　　翻转肽的类似物是其中仅有部分序列是反向的并用对映体的氨基酸残基取代的多肽。因为此种类似物的反向

　　翻转肽类似物的合成描述于bonelli，f.等人，int j pept protein res.24(6)：553

　　6(1984)；verdini，a和viscomi，g.c，j.chem.soc.perkin trans.1：697

　　701(1985)；以及美国专利6,261,569中，它们全文以引用方式并入本文。已经描述了部分反向

　　术语“同源性”、“同一性”和“相似性”是指在两个肽或两个最优比对的核酸分子之间的序列相似性程度。同源性和同一性可各自通过比较在各个序列中的位置进行测定，所述序列可对齐用于比较目的。例如，它基于在默认位置使用标准同源性软件，例如blast，2.2.14版。当比较序列中的等效位置被相同碱基或氨基酸占据时，则该分子在该位置相同；当等效位点被相似氨基酸残基(例如空间和/或电子性质相似，诸如保守氨基酸取代)占据时，则该分子可称为在该位置同源(相似)。以同源性/相似性或同一性的百分比的表示分别是指在比较序列共有位置处的相似或相同氨基酸数目的函数。“不相关的”或“不同源的”序列与如本文所公开的序列具有小于40％的同一性，但优选地小于25％的同一性。

　　如本文所用，术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口上相同(即，基于核苷酸

　　残基)。术语“序列同一性百分比”如下计算：对比较窗口内两个最佳比对的序列进行比较，确定在两个序列中存在相同核酸碱基(如a、t、c、g、u或i)或残基的位置的数量以获得相匹配的位置的数量，用相匹配的位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100，从而获得序列同一性百分比。

　　如本文所用，术语“基本上相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的特点，其中，所述多核苷酸或氨基酸含有如下序列：在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口中、通常为在至少24

　　16个氨基酸)位置的窗口中，相比参比序列而言具有至少85％的序列同一性，优选至少90％至95％的序列同一性，更通常为至少99％的序列同一性，其中，序列同一性百分比通过在比较窗口中将参比序列与可含有缺失或添加(总计为参比序列的20％或更少)的序列进行比较来计算。参比序列可为较大序列的子集。当用于描述多肽时，术语“相似性”通过将一条多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代与第二条多肽的序列进行比较来确定。

　　如本文所用，术语“同源的”或“同系物”可互换使用，并且，在用于描述多核苷酸或多肽时，表示当进行最佳比对和比较(例如使用具有用于比对的默认参数的blast，2.2.14版(参见本文))时，两个多核苷酸或多肽、或其指定序列是相同的，其中在至少70％的核苷酸、通常从约75％至99％、更优选至少约98％至99％的核苷酸中具有适当的核苷酸插入或缺失或氨基酸插入或缺失。如本文所用，术语“同系物”或“同源的”也指相对于结构和/或功能的同源性。对于序列同源性，如果序列为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％相同的，至少97％相同的，或者至少99％相同的，则它们是同系物。对本发明

　　术语“基本上同源”是指至少90％、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。同源序列可以是不同物种中的相同功能基因。对本发明的基因或肽的同系物的确定可由本领域技术人员容易地确定。

　　对于序列比较，通常一个序列作为参比序列，将测试序列与该参比序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分比。

　　可通过如下方式进行用于比较的序列的最佳比对：例如，smith和waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2：482(1981)，其以引用方式并入本文)、needleman和wunsch的同源性比对算法(j.moi.biol.48：443

　　53(1970)，其以引用方式并入本文)、pearson和lipman的相似性检索方法 85：2444

　　48(1988)，其以引用方式并入本文)、这些算法的计算机化执行(例如wisconsingenetics软件包中的gap、bestfit、fasta、和tfasta，genetics computer group，575science dr.，madison，wis.)、或目测检查。(一般参见ausubel等人(eds.)，current protocols in molecular biology，第4版，john wiley和sons，new york(1999))。

　　可用的算法的一个示例是pileup。pileup使用渐进的成对比对，由一组相关序列创建多序列比对，以显示序列同一性百分比。它还绘制树或系统树图(dendogram)来显示用于创建比对的聚类关系。pileup使用feng和doolittle的渐进比对方法(j.moi.evol.25：351

　　60(1987)，其以引用方式并入本文)的简化版。所用方法与higgins和sharp所述方法(comput.appl.biosci.5：15l

　　53(1989)，其以引用方式并入本文)相似。该程序可比对多达300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对过程从成对比对两个最相似的序列开始，生成两个比对序列的簇。然后，将该簇与下一个最相关的序列或对比序列的簇进行比对。通过两个单独序列的成对比对的简单延伸来对比两个簇的序列。最终比对通过一系列渐进的成对比对来实现。该程序通过为序列比较区指定特定的序列以及它们的氨基酸或核苷酸坐标并通过指定程序参数来运行。例如，可使用以下参数将参比序列与其它测试序列进行比较，从而确定序列同一性百分比关系：默认空位权重(3.00)，默认空位长度权重(0.10)和加权的末端空位。

　　适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的另一示例是blast算法，该算法由altschul等人描述(j.moi.biol.215：403

　　410(1990)，其以引用方式并入本文)。(也参见zhang等人，nucleic acid res.26：3986

　　90(1998)；altschul等人，nucleic acid res.25：3389

　　402(1997)，它们以引用方式并入本文)。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)的互联网网站公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中的长度w的短字(short words)来识别高得分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，该高得分序列对匹配或满足一些正阈值评分t。t称为相邻字计分阈值(neighborhoodword scorethreshold)(altschul等人(1990)，同上)。这些初始的相邻字命中(hits)用作起始搜索的种子以寻找含有它们的更长的hsp。然后，这些字命中在两个方向沿着每个序列在累积比对得分能够增加的范围内尽可能向远延伸。当发生下列情况时每个方向的字命中的延伸停止：累积比对

　　得分由其最大获得值下降了数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏性和速度。blast程序使用的默认值为：字长度(w)为11，blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa 89：10915

　　9(1992)，其以引用方式并入本文)比对值(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝

　　除计算百分比序列同一性之外，blast算法还执行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如karlin和altschul，proc.natl.acad.sci.usa 90：5873

　　77(1993)，其以引用方式并入本文)。由blast算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallest sum probability，(p(n))，其提供在两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试氨基酸与参考氨基酸的比较中最小和概率小于约0.1、更典型小于约0.01，并且最典型地小于约0.001，那么认为该氨基酸序列与参考氨基酸序列相似。

　　如本文所用，术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸或核酸缺失、添加、取代或侧链修饰而不同于多肽或核酸，但保留了这些天然存在的分子的一种或多种特定功能或生物学活性的肽或核酸。氨基酸取代包括其中氨基酸用不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基取代的改变。此类取代可归类为“保守的”，在这种情况下，用在极性、侧链功能或尺寸方面具有相似性质的另一天然存在的氨基酸替换多肽中包含的氨基酸残基。此类保守取代是本领域熟知的。本发明所涵盖的取代也可为“非保守的”，其中，用具有不同特性的氨基酸(例如，来自不同组的天然存在的氨基酸)取代存在于肽中的氨基酸残基(例如，用丙氨酸取代带电的氨基酸或疏水性氨基酸)；或者，其中用非常规氨基酸取代天然存在的氨基酸。在一些实施方案中氨基酸取代是保守的。当用于多核苷酸或多肽时，该术语变体也涵盖在分别与参比多核苷酸或多肽相比(例如与野生型多核苷酸或多肽相比)时，在一级结构、二级结构、或三级结构中可存在变化的多核苷酸或多肽。

　　变体也可为使用本领域公知的方法分离或生成的合成的、重组的、或化学修饰的多核苷酸或多肽。如下所述，变体可包含保守氨基酸改变或非保守氨基酸改变。多核苷酸的改变可导致由参比序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。变体还可包含氨基酸的插入、缺失或取代，包括通常不出现在作为变体基础的肽序列中的氨基酸和其它分子的插入和取代，例如但不限于通常不出现在人蛋白中的鸟氨酸的插入。术语“保守取代”当描述多肽时，是指多肽的氨基酸组成的变化，该变化基本上不改变多肽的活性。例如，保守取代是指将一个氨基酸残基取代成具有相似的化学特性的不同氨基酸残基。保守氨基酸取代包括用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、或者用丝氨酸取代苏氨酸。

　　[0184]“保守氨基酸取代”由一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换所导致，例如将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸替换为谷氨酸、或将苏氨酸替换为丝氨酸。因此，特定氨基酸序列的“保守取代”是指将对于多肽活性不关键的那些氨基酸进行取代，或用具有相似性质(例如酸性、碱性、正电性或负电性、极性或非极性等)的其它氨基酸对氨基酸进行取代，从而即使是对关键氨基酸的取代也不降低肽的活性(即，所述肽透过血脑屏障(bbb)的能力)。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。例如，以下六组每组包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(a)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)，赖氨酸(k)；5)异

　　也旨在包括等位基因种类和诱导的变体。类似物通常在一个或几个位点上与天然存在的肽不同，这常常通过保守取代。类似物通常表现出与天然肽至少80或90％的序列同一性。一些类似物也包括非天然的氨基酸或n或c末端氨基酸的修饰。非天然氨基酸的示例为例如但不限于二取代的氨基酸、n

　　甲基精氨酸。可在如下所述的转基因动物模型中筛选片段和类似物的预防或治疗功效。

　　[0193]“共价键合的”是指通过共价化学键直接或间接(例如通过接头)连接。在本发明的所有实施方案的一些方面，融合肽是共价键合的。

　　如本文所用，术语“融合蛋白”是指两个或更多个蛋白的重组蛋白。融合蛋白例如可通过以下方式生产：将编码一个蛋白的核酸序列与编码另一蛋白的核酸连接，从而它们构成单个开放阅读框，该开放阅读框在细胞中能够翻译成带有所有目的蛋白的单个多肽。蛋白的排列顺序可不同。融合蛋白可包括表位标签或半衰期延长剂。表位标签包括生物素、flag标签、c

　　myc、血球凝集素、his6(seq id no：37)、洋地黄毒苷、fitc、cy3、cy5、绿荧光蛋白、v5表位标签、gst、β

　　半乳糖苷酶、au1、au5、和抗生物素蛋白。半衰期延长剂包括fc结构域和血清白蛋白。

　　术语“受试者”和“个体”以及“患者”本文可互换使用，并且是指动物，例如人类或非人类的动物(例如哺乳动物)，向它们提供如本文所公开的药物组合物进行治疗，包括预防性治疗。如本文所用，术语“受试者”是指人类或非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，诸如非人类的灵长类动物(尤其是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子、奶牛、以及非哺乳动物如鸡、两栖动物、爬行动物等等。在一个实施方案中，受试者是人类。在另一个实施方案中，受试者是作为疾病模型的实验动物或替代动物。非人类的哺乳动物包括哺乳动物如非人类的灵长类动物(尤其是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子和奶牛。在一些方面，非人类的动物是伴侣动物如狗或猫。

　　[0196]“治疗”受试者的疾病或病症或者“治疗”患有疾病或病症的患者是指使个体经受药物治疗，例如施用药物，使得疾病或病症的至少一种症状减轻或稳定。通常，当治疗性给予所述肽作为治疗时，将它给予表现出例如ami的一种或多种症状的受试者。

　　术语“预防”与从无症状状态时预防症状或延缓症状发展关联使用。通常，当预防性给予所述肽时，将它给予不表现出如本文所述病症(例如ami)的临近症状的受试者。通常，受试者面临发展出梗死或与细胞因子风暴相关联的疾病如ami的风险，这是由于家族病史、实验室结果、基因测试或生活方式导致的。所述肽也可在例如ami或中风的症状的发作后或在诊断出所述症状后的10

　　60分钟内给予，或者在10分钟至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，直至2、3、4、5天内给予，以预防症状恶化。所述肽也可在受伤和/或指示事件后的10

　　60分钟内给予，或者在10分钟至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，直至2、3、4、5天内给予，以预防症状恶化。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽可在受伤和/或指示事件后10

　　[0198]“特异性地结合”或“特异性结合”是指识别和结合所需的多肽但基本上不识别和

　　结合样品(例如生物样品)中的其它分子的化合物或抗体，这自然包括本发明的多肽。特异性结合可通过至少约1x10

　　6m或更小的解离常数来表征。在其它实施方案中，解离常数为至少约1x10

　　9m。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子共振等等。

　　[0199]“分离的”是指多肽已经与任何自然环境诸如体液如血液隔离，并且与天然伴随所述肽的组分分离。

　　分离的和“基本上纯的”是指已被分离并纯化的多肽，该多肽与天然伴随其的组分至少某种程度上分离。通常，当多肽按重量计至少约60％，或者至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，或者甚至至少约99％没有天然缔合的蛋白和天然存在的分子时，它是基本上纯的。例如，基本上纯的多肽可通过以下方式获得：通过从天然来源中提取、通过在通常不表达该蛋白的细胞中表达重组核酸、或通过化学合成。

　　α水平的上下文中使用的“减少”或“抑制”是指生物样品如血液或组织样品、细胞、细胞提取物或细胞上清液中蛋白量的下降。例如，此类降低可由下降的rna稳定性、转录或翻译、增加的蛋白降解或rna干扰所致。优选地，与参考值相比，这种降低为至少约5％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约80％，或者甚至至少约90％。

　　在权利要求书和本专利申请的上下文中，术语“参考值”通常是指受炎症影响或患有炎症的个体内存在的异常高的tnf

　　α量。在关于血糖控制的所有实施方案的一些方面，术语“参考值”是指用于测量受试者内的血糖控制的数值。米乐M6官网登录入口有多个测试可用于测定例如人类受试者是否受到糖尿病前期的影响。此类测试包括例如a1c测试、空腹血糖测试(fpg)、以及口服葡萄糖耐量测试(ogtt)。

　　基因或蛋白的表达或活性的“提高”是指细胞、细胞提取物、或细胞上清液中蛋白或核酸的水平或活性的正向改变。例如，这种提高可由于提高的rna稳定性、转录、或者翻译、或者降低的蛋白降解而引起。优选地，这种提高高出在对照条件下的表达或活性水平至少5％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约80％，至少约100％，至少约200％，或者甚至约500％或更高。

　　当用于描述核酸分子时，本文所用的术语“重组体”是指基因组、cdna、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作原因，该多核苷酸不与其在自然界中关联的多核苷酸的全部或部分关联。当用于蛋白或多肽时，术语重组体是指通过重组多核苷酸的表达而产生的多肽。当用于宿主细胞时，术语重组体是指向其中引入了重组多核苷酸的宿主细胞。就某物质(例如细胞、核酸、蛋白或载体)而言，重组体在本文中也用来指所述物质已通过引入异源物质(例如细胞、核酸、蛋白或载体)进行修饰。

　　术语“载体”是指能够运送与其连接的另一核酸的核酸分子；质粒是由“载体”所包含的种类的一个类型。术语“载体”通常是指含有复制起点和对于在宿主细胞中复制和/或维持所必需的其它实体的核酸序列。能够引导它们可操作地连接的基因和/或核酸序列表达的载体本文称为“表达载体”。通常，具实用性的表达载体通常处于“质粒”形式，这是指环状双链dna环，处于其载体形式的dna环不与染色体结合，并且通常包含用于稳定表达或瞬时表达编码dna的实体。可用于本文所公开的方法的其它表达载体例如但不限于质粒、游离体(episomes)、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes)、酵母人工染色体、

　　噬菌体或病毒载体，并且此类载体可整合到宿主基因组中，或可在特定细胞中自主复制。载体可为dna或rna载体。也可使用本领域技术人员已知的提供等同功能的其它形式的表达载体，例如自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组中的载体。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们所连接的核酸的那些。能够引导它们可操作地连接的基因表达的载体本文称为“表达载体”。

　　术语“病毒载体”是指利用病毒、或病毒相关联的载体作为进入细胞的核酸构建体的载体。构建体可被整合并包装进非复制、缺陷型病毒基因组(像腺病毒、腺相关病毒(aav)、或单纯疱疹病毒(hsv)或其它，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体)，用于感染或转导到细胞中。载体可掺入也可不掺入细胞基因组。如果需要，构建体可包括用于转染的病毒序列。另选地，构建体可掺入能够游离复制的载体，例如epv和ebv载体。

　　冠词“一个(a/an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。以举例的方式，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。除非在操作实施例中或另有说明，本文所用的表示成分的量或反应条件的所有数字在所有情况下均应被理解为由术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可意指+1％。本发明还通过以下实施例详述，但是本发明的范围不应受它们的限制。

　　应当理解，本发明不受本文所述的具体方法、方案和试剂等的限制，并且因此可以是变化的。本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围只通过权利要求进行定义。从以下详细描述、附图和权利要求书中，本发明的其它特征和优点将显而易见。

　　本发明的一个方面涉及本文所述的肽和其突变体、变体、类似物或衍生物的用途。具体地，这些方法涉及将如本文所述的任何一种肽或它们药学上可接受的修饰形式在药学上可接受的载体中给予受试者，例如需要其的哺乳动物，例如人类，即，患有与细胞因子风暴相关联的疾病的受试者；需要减少梗死面积的受试者；和/或需要治疗ami的受试者。这些疾病和病症的临床描述是熟知的。在一些方面，人在给予本发明的一种或多种肽之前首先诊断患有疾病的一种或多种症状。在一些实施方案中，人之前未曾被给予aat作为症状的治疗方法。

　　如本文所用，“与细胞因子风暴相关联的”的疾病是其中细胞因子风暴是疾病的起因，疾病的症状，或疾病的发病结果的疾病。与细胞因子风暴相关联的疾病的非限制性示例可包括急性心肌梗死(ami)；痛风；中风；心脏手术并发症；和/或外伤性脑损伤。

　　需要减少梗死面积的受试者可为患有梗死的受试者。需要减少梗死面积的受试者可为患有或诊断患有例如急性心肌梗死(ami)；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；和/或中毒性休克的受试者。

　　如本文所用，“急性心肌梗死”或“ami”是指减少或停止流向心脏的血流，这可能通过多种原因导致心脏组织破坏。

　　在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不患有选自以下的病症、不患有选自以下的病症的症状、和/或不诊断患有选自以下的病症：ii型糖尿病、狼疮、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、湿疹、牛皮癣、囊性纤维化病、类风湿性关节炎、急性放射综合征、烧伤、炎性肠病、i型糖尿病、和高血糖。

　　例如已在建立用于包括ami的人类疾病的临床前小鼠模型中显示例如sp16肽显著改善症状。例如，sp16显示减少梗死面积。

　　使用广为接受的临床前安全研究，也已经提供了例如sp16肽可被安全给予的证据。例如，在ami模型中也已经显示sp16不影响心脏收缩性。另外，使用fastpatch分析已显示例如sp16肽不影响herg活性，并且另外不能鉴定在人类受体淘选研究(gensep explorer)中对sp16肽的任何命中。

　　因此，在一个方面提供了用于治疗患有与细胞因子风暴相关联的疾病的受试者；需要减少梗死面积的受试者；和/或需要治疗ami的受试者的方法，该方法包括向需要其的人类受试者给予包含本发明的至少一种肽的组合物。在一些方面，所述肽包含sp16。

　　2激动剂。因此，不希望受理论的约束，所述肽如sp16用作抗炎药物，其通过促进抗炎细胞因子分布而起作用。另外，不希望受理论的约束，所述肽如sp16也能够用作免疫调节剂，其通过诱导致耐受性且保护性的t

　　regs)的扩增而起作用。此外，不希望受理论的约束，与一般抑制免疫系统的大多数当前可用的治疗方法(用一般的免疫抑制剂治疗同时使受治疗的个体暴露于感染风险)相比，所述肽如sp16也能够在不诱导一般免疫抑制的情况下下调自体免疫响应，从而提供对自体免疫疾病的优异治疗。

　　因为所述肽来源于aat，并且根据体内和体外模型的结果，预期大多数aat的治疗效应也适用于本发明的肽(如sp16)是合理的。具体地，aat已经显示调节t

　　诱导的基因表达和内皮细胞的细胞凋亡；预防大肠杆菌i)引起的红细胞溶血，减少循环的嗜曙红细胞数；抑制中性粒细胞趋化、nadhp氧化酶和anca信号转导；抑制单核细胞和巨噬细胞细胞因子释放和cd14表达的调节，并且抑制肥大细胞组胺释放；以及调节b

　　细胞增殖和细胞因子产生。在一些方面，所述肽是sp16，其可包含通常用于提高肽的生物利用率和/或贮存期限的一种或多种修饰，例如聚乙二醇化等等。

　　tm mtlr2，invivogen)的实验获取数据。细胞用20μg/ml的指示肽孵育24小时。在tlr2活化时，细胞分泌碱性磷酸酶，其可被检测到。该检测一式三次进行，并且用平均值作曲线是乱序肽对照(黄色)，并且pam(pam3csk4；红色)是阳性对照。参见例如pct/us13/20498；该专利以引用的方式全文并入本文。

　　pk参数sp16，iv(5mg/kg)c0(μg/ml)2.5至最后的auc(μg

　　hr/ml)0.9t1/2(hr)1.9总cl(ml/hr)140总cl(ml/min/kg)9.7最后时间点8.0mrtinf(hr)1.1v(ml)374

　　进行该分析时，三只正常大鼠静脉内注入5mg/kgsp16，并且在注入后的8个时间点测定sp16的血浆浓度。对于每个时间点，通过lc/ms/ms测定sp16水平，并且所述值用于计算cmax(2.5ug/ml)和t1/2(1.9小时)。测定通过apredica，boston，ma执行。因此，sp16经测定在正常大鼠中具有1.9小时的半衰期。

　　sp16安全特征也包括herg数据。herg fastpatch分析表明sp16在多达25μm的剂量下不抑制herg。这一数据预测sp16在人中将不具有心脏安全问题。该研究通过apredica，boston，ma执行。

　　此外，还使用人类受体淘选进行分析。gensep explorer面板包含111个体外测定靶，它们经仔细选择以评估药物/化学品的生物活性。测定类别包括gpcr、电压门控离子通道、配体门控离子通道、神经递质转运体、核受体和类固醇、以及不同组的生物化学靶，包括磷酸二酯酶、激酶和其它相关的酶。该研究通过caliperlifesciences执行，并且结果汇总在下表中。看起来sp16对111种人类受体无效应，指示sp16具有优异的人体安全特征。

　　根据sp16的安全特征，可以合理地外推出本文提供的其它肽片段在给予人时也将

　　在一个实施方案中，本文所述的治疗方法还包括选择或诊断患有任何上述病症的受试者，例如在给予如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物之前由炎症引起的病症，从而治疗病症或功能不良，诸如炎症。此类选择由技术人员通过多种可用的方法进行，例如评估本文所述的症状。例如，ami可通过例如心电图、胸片、或肌钙蛋白水平进行诊断。例如，能够评估受试者内的tnf

　　反应性蛋白作为炎症或治疗功效的标记物。如果体内某处存在高度怀疑的组织受伤或感染，c

　　反应性蛋白(crp)用于检测炎症。crp用作感染和炎症的一般标记物，并且可用于评估个体的急性或慢性炎症状况。血液中的高或提高的crp量表明存在炎症。在怀疑患有严重细菌感染的个体中，高crp表明存在感染。在患有慢性炎性病况的人中，高水平的crp表明疾病发作或者治疗尚未生效。健康人血清中的正常浓度通常低于10mg/l，随着年龄增长略微增加。较高的水平见于晚孕女性、轻度炎症和病毒感染(10

　　200mg/l)、严重细菌感染和烧伤(＞200mg/l)。在一些方面，术语“参考值”是指当使用crp作为炎症的诊断测试时，crp的测量值。

　　成功的或有效的治疗通过减轻如本文所述的病症或功能不良的一种或多种症状来证明。期望将如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物给予需要其的受试者以预防或延缓本文所述的病症和机体功能不良的发展(例如起因于梗死、细胞因子风暴、炎症或自体免疫组织破坏的那些，或者在患有糖尿病的个体内通过刺激β细胞量扩增减轻的病症)。术语“预防”用于指其中受试者仍未患有经预防的具体病症的情况，意指它尚未以任何可察觉的形式显露。预防涵盖预防或延缓症状的发生和/或严重度(包括其中受试者已经患有另一种病症的一种或多种症状的情况)。预防一般在具有发展出病症或机体功能不良的受试者中进行。认为此类受试者需要预防。例如，与在给予本发明的肽之前的水平相比，tnf

　　在一个实施方案中，本文所述的预防方法还包括在向受试者给予肽或其突变体、变体、类似物或衍生物之前，选择具有患某种病症风险的受试者，例如本文所述的起因于梗死、细胞因子风暴、炎症或自体免疫组织破坏或机体功能不良的那些，从而预防所述病症或功能不良。此种选择由技术人员通过多种可用的方法进行。例如，评估风险因素或诊断已知引起病症或功能不良的疾病、或者已知引起病症或功能不良的治疗或疗法。一般认为患有疾病或受伤或具有相关家族病史(已知促进病况)的受试者具有增加的风险。

　　如本文所用，术语“治疗”是指治疗措施，其中目标是预防或延缓疾病的发展，例如减少与炎症相关联的病症、疾病或病况的至少一种影响或症状。取决于病症，如果一种或多种症状得到改善或者临床标记物如肌钙蛋白、tnf

　　α、crp、血糖和/或hba1c的水平在正常值范围内或比反映炎症或血糖控制不良的异常值更接近正常参考值，根据本文对该术语的定义，治疗是一般“有效的”。另选地，如果疾病的发展减缓、症状的表现或疾病标记物减少，则治疗是“有效的”。即，“治疗”包括改善症状或标记物、延缓发展或延缓至少一种症状的恶化(如果不进行治疗，预期将发生恶化)。有益的或期望的临床结果包括但不限于缓解一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定病情(即，不恶化)、延缓或减缓疾病发展、缓解或减轻病情。“治疗”也可指与如果不接受治疗的预期存活期相比，延长的存活期。需要治疗的那些包

　　括患有梗死、细胞因子风暴、或炎症的一种或多种症状，诸如与ami相关联的症状的患者。

　　在一些方面，本发明涉及预防细胞因子风暴、梗死，和/或ami的方法，该方法通过将所述的肽给予仍未表现出细胞因子风暴、梗死、和/或ami的症状的个体进行。例如，可将所述肽给予具有发展成ami的高风险、但是仍未患有ami的个体，用于帮助延缓ami的发展或预防ami的发展。

　　如本文所用，术语“有效量”是指包含一种或多种如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物的量，它们用于减少疾病或病症的至少一种或多种症状，并且涉及足量的药理组合物以提供期望的效果。如本文所用，短语“治疗有效量”是指足量的组合物，其用于治疗病症，具有合理的效/险比，可用于任何医学治疗。因此，术语“治疗有效量”是指如本文所公开的组合物的量，当给予患有例如ami的典型受试者时其足以实现与提高水平的炎症、梗死、或细胞因子风暴相关联的症状或临床标记物的治疗学上或预防学上的减少。通常疾病标记物如炎性标记物(例如tnf

　　α)超过20％的减少指示有效治疗。在某些情况下，在给予本发明的肽之前个体内tnf

　　治疗学上或预防学上显著的症状减少为与对照或未治疗的受试者或在给予所述肽之前的受试者状态相比，测量参数的例如至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约125％，至少约150％或更多。测量的或可测量的参数包括临床上可检出的疾病标记物，例如提高或降低的生物标记物如tnf

　　α的水平，以及涉及临床上接受的症状量度或梗死、细胞因子风暴、和炎症的标记物的参数。然而，应当理解，如本文所公开的组合物和制剂的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。所需的精确的量将根据多种因素而变化，诸如待治疗的疾病类型、受试者的性别、年龄和体重。

　　对于治疗患有与细胞因子风暴相关联的疾病的受试者；需要减少梗死面积的受试者；和/或需要治疗ami的受试者，术语“治疗有效量”是指用于延缓一种或多种症状的发展并导致疾病标记物如tnf

　　α或crp浓度的量降低的安全且足够的量。疾病的治疗有效量取决于疾病类型、受治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、给予模式等等。因此，规定精确的“有效量”是不可能的。然而，对于任何给定病例，合适的“有效量”可由本领域的普通技术人员仅利用常规实验来测定。治疗效果可由本领域的普通技术人员进行判断，例如，治疗效果可在炎症(例如lps模型)、ami(例如异丙肾上腺素模型)、自体免疫组织破坏(例如caia模型)或糖尿病(例如db/db小鼠模型)的已知动物模型中进行评估。当使用实验动物模型时，当细胞因子风暴或梗死的症状相对于未治疗动物显示减少时，治疗效果得到证实。

　　在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不患有选自以下的病症、不患有选自以下的病症的症状、或者不诊断患有选自以下的病症：ii型糖尿病、狼疮、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、湿疹、牛皮癣、囊性纤维化病、类风湿性关节炎、急性放射综合征、烧伤、炎性肠病、i型糖尿病、和高血糖。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不具有提高的tnf

　　如本文所用，术语“给予”和“引入”本文可互换使用，并且是指将如本文所公开的

　　治疗剂如一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物通过某种方法或途径置于受试者内，所述方法或途径导致递送此类治疗剂至期望的部位。可通过任何合适的途径给予化合物，这导致对受试者的有效治疗。

　　如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物可通过本领域已知的或本文所述的任何途径给予，例如口服、肠胃外(例如静脉内或肌内)、腹膜内、经直肠、经皮、经鼻、经、吸入、皮肤(贴剂)、或经眼部。如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物可以任何剂量或剂量方案给予。也可利用泵，例如用于胰岛素给予的泵。在一些实施方案中，一种或多种肽可口服给予。如美国专利8,975,224的图16所示；该专利以引用的方式全文并入本文，例如与腹膜内注射sp16和相比，sp16的口服给予显示有效。

　　对于本发明的治疗方法，它不旨在如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的给予受具体给予模式、剂量、或给予频率的限制；本发明设想所有给予模式，包括肌内、静脉内、腹膜内、囊内、关节内、病灶内、皮下、或者任何其它途径给予，它们足以提供足够治疗例如炎症、梗死、或细胞因子风暴相关的病症的剂量。治疗剂可以单剂量或多剂量给予患者。当给予多剂量时，剂量可彼此间隔例如一小时、三小时、米乐M6官网登录入口六小时、八小时、一天、两天、一周、两周、或一个月。例如，治疗剂可给予例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、或更多周。应当理解，对于任何特定受试者，根据个体需要以及给予或监督给予组合物的人员的职业判断，应随时间推移调整具体剂量方案。例如，如果较低的剂量不提供足够的治疗活性，可提高治疗剂的剂量。

　　虽然主治医师最终将决定适合的量以及给予方案，如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的治疗有效量可为0.0001、0.01、0.01、0.1、1、5、10、25、50、100、500、或1,000mg/kg或μg/kg的剂量。有效剂量可由来源于体外或动物模型测试生物分析法或系统的剂量

　　用于特定患者或受试者的剂量可由本领域的普通技术人员利用常规考虑(例如通过合适的常规药理方案)来确定。医师可例如首先开出相对低剂量的药方，随后提高剂量直至获得合适的响应。给予患者的剂量随时间推移足以在患者中实现有益的治疗响应、或者例如减少症状、或者其它合适的活性，这取决于应用。剂量由以下因素确定：具体制剂的功效、以及如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的活性、稳定性或血清半衰期、以及患者状况、以及待治疗的患者的体重或体表面积。剂量大小也由伴随具体载体、制剂等等给予具体受试者的任何不良副作用存在与否、性质、和程度来确定。根据本领域熟知的方法，包含如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的治疗组合物任选地在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中进行测试，例如炎症或糖尿病模型，从而确认疗效、组织代谢、以及估算剂量。具体地，剂量可初始通过相关测定法对治疗与未治疗(例如治疗对未治疗的细胞或动物模型的比较)的活性、稳定性或其它合适的测量来确定。制剂给予速率通过相关制剂的ld50和/或对如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的任何副作用的观察来确定。给予可经由单剂量或分开的剂量完成。

　　在对如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物(它们给予

　　以治疗或预防疾病)的有效量的测定中，医师评估循环血浆水平、制剂毒性、和疾病的发展。

　　化合物的功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序进行测定，例如ed50(剂量对50％的群体有效)和ld50(剂量对50％的群体致命)。毒性对治疗效果的剂量比率是治疗指数，并且它可表示为比率ld50/ed50。表现出高治疗指数的药物组合物是优选的。

　　这些化合物可通过任何合适的给予途径给予人和其它动物用于治疗，所述途径对小的肽有。