最高编辑效率可达77%北大魏文胜团队开发新型线米乐M6官网登录入口粒体碱基编辑器
线粒体 DNA（mtDNA）突变会导致多种遗传性疾病，包括线粒体肌病、母系遗传 Leigh 综合征、Leber 遗传性视神经病等等。由于多数线粒体疾病是由 mtDNA 点突变引起，因此，通过碱基编辑方式纠正突变是一种极具前米乐M6官网登录入口景的治疗策略。
近日，北大魏文胜课题组开发出了一种新型的线粒体碱基编辑器——mitoBEs，可以精确编辑出现突变的 mtDNA。该工具包含 3 个部分，具有定位功能的可编程转录激活子样效应因子（TALE）结合蛋白，切口酶 MutH 或 Nt.BspD6I（C）以及脱氨酶。
根据官方新闻稿的描述，该工具不依赖于 DddA 系统，后者是一种可作用于双链 DNA 的脱氨酶，可将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。通过全基因组测序，mitoBEs 在线粒体和细胞核中都没有检测到明显的脱靶现象，这证明该碱基编辑器具有高度特异性和安全性。
值得一提的是，通过递送环状 RNA 编码的 mitoBEs 碱基编辑器，该工具纠正了患者来源的致病性线粒体 DNA 突变。论文中指出，这也是
通过碱基编辑方式修正了线粒体的致病突变。论文中还提到，mitoBEs 提供了一种更精确、高效的 DNA 编辑工具，可广泛应用于
治疗中。博士后研究员伊宗裔、博士研究生张小雪是该研究的共同第一作者，魏文胜为本研究的通讯作者。
此前，修改线粒体 DNA 常用的方法是利用无 RNA 系统的核酸酶，包括 TALEN 和 ZFN 技术。不过，由于 TALEN 和 ZFN 系统通常通过直接降解突变的 mtDNA 来消除突变，以此实现增加野生型 mtDNA 的比例。野生型 mtDNA 与突变型 mtDNA 的比例通常与线粒体疾病临床表型的严重程度相关。
2020 年以来，领域内开发出的比较有代表性的线粒体碱基编辑工具包括 DdCBE 和 TALED。DdCBE 是刘如谦团队基于一种双链 DNA 脱氨酶毒素 A（DddA）开发的线粒体碱基编辑器，将 DddA 分裂半体与 TALE 和尿嘧啶糖基化酶抑制剂融合，首次实现了 mtDNA 碱基序列从 C→T，编辑效率约为 4.6%~49%；TALED 是 Jin-Soo Kim 提出的一种 DddA 和 TadA8e 组合的碱基编辑工具，由 TALE 蛋白、DddA 变体以及工程化的腺嘌呤脱氨酶组成。该工具能够靶向诱导线粒体中碱基序列的 A→G，编辑效率约为 49%。
不过，后续，科学家们发现 DddA 系统存在比较严重的脱靶效应，尤其是 DddA 与 CTCF 之间存在相互作用，会引发细胞核基因组的米乐M6官网登录入口非特异性编辑。
在此背景下，该研究团队决定开发一种不依赖于 DddA 系统、更高效精确编辑的线粒体编辑工具。官方新闻稿中提到，除 DddA 之外，目前发现的 DNA 脱氨酶都只能作用于单链 DNA，基于此，研究人员设想在靶向位点产生瞬时的单链 DNA，可以为所有“普通” 脱氨酶提供有效反应底物。因此，
具体来说，通过切割酶切开目标位点，产生瞬时 ssDNA，从而允许脱氨酶（如 TALE-TadA8e-V106W）将单链 DNA 上的腺嘌呤脱氨基，实现 A 转换为 G。
在试验中，首先当使用工程化的脱氧腺苷脱氨酶 TadA8e-V106W 与 TALE 结合时，研究人员在所有三个靶向位点 MT-ND1、MT-ND4 和 MT-RNR2 检测到非常低水平的编辑，编辑率为 0.39%。由于 TALE 无法解开 DNA 双螺旋结构，单独使用 TadA8e-V106W 也无法诱导有效的脱氨反应，难以编辑 mtDNA。
研究人员将这种 A→G 编辑系统称之为mitoABEMutH，在 HEK293T 细胞中，研究团队证实了 mtDNA 编辑结果具有持久性，这一结果在三个目标位点持续了超 15天。“这些结果表明，我们提出了一个理论模型，其可以解释 TALE-切口酶和 TALE-脱氨酶组合如何实现 mtDNA 碱基编辑。”
然后，研究团队还通过位点定向突变尝试扩大mitoABEMutH的靶向范围。
紧接着，他们还将这种策略扩展到了其他类型的脱氨酶，用 rAPOBEC1 替换了 TadA8e-V106W，使用 TALE-rAPOBEC1-2×UGI 和 TALE-MutH 的组合实现线粒体碱基序列 C→T 的编辑，最大编辑效率约为 30%。研究团队将这种 C→T 的碱基编辑系统称之为mitoCBEMutH。
在 mtDNA 测序分析中，在所有 mitoABE 实验组中均未检测到非特异性编辑；与具有相同 TALE 阵列的 DdCBE 相比，mitoCBE 在线粒体基因组中诱导了较少的脱靶编辑，尤其是在 MT-ND4 位点上。“这些结果表明，mitoBE 是一类可靠的线粒体编辑工具，对 mtDNA 的脱靶编辑最少。”
接着，研究团队通过全基因组测序分析了在细胞核基因组中的脱靶效应，mitoBE 在核基因组中表现出较低的脱靶效应。通过实时定量 PCR 分析，研究团队进一步证实了目标组 mtDNA 的拷贝数和完整性与对照组保持一致。“整体来看，mitoABE 在人类细胞中表现出高度特异性。”
验证了 mitoBE 的安全性和有效性之后，研究人员进一步测试了该碱基编辑器应用于疾病治疗中的潜力。研究者将环状 RNA 编码的 mitoBEs 递送到不同的人类细胞类型中，包括 H1299、MCF7、Huh7 和 RPE1。
由于线粒体相关遗传疾病的主要病因是线粒体呼吸复合体组装缺陷导致 ATP 生成减少引发。研究人员将环状 RNA 编码 mitoABE 靶向 HEK293T 细胞中三个基因起始密码子，并测试了该编辑工具生成真实线粒体疾病模型的可行性。试验结果显示，mitoABE 改变了所靶向三个位点的 ATG 起始密码子，且编辑效率分别为 34%、18% 和 36%，并且在这三个位点进行编辑也使细胞内 ATP 含量降低。
▲图 环状 RNA 编码的 mitoABEs 在 LHON 细胞中成功构建疾病模型，以及纠正了突变（来源：NBT）
在试验中，研究团队将环状 RNA 编码的 mitoABE 靶向 LHON 患者来源的 GM10742 细胞中，检测到 mitoABE 对致病突变的修复效率为 20%。更重要的是，通过 mitoABE 纠正后， GM10742 细胞中 ATP 含量和呼吸耗氧率得以显著增加。Leber 遗传性视神经病变是一种视神经退行性变的母系遗传性疾病，也是一种最常见的导致青壮年致盲的疾病，男性患者居多，通常由三种致病性 mtDNA 点突变之一引起。
